凝血酶工艺优化和稳定性的研究

袁湘杰，王晓非，王丽红*

（吉林大学白求恩制药厂，吉林 长春 130021）

凝血酶工艺优化和稳定性的研究

袁湘杰，王晓非，王丽红*

（吉林大学白求恩制药厂，吉林 长春 130021）

目的进行凝血酶工艺优化和稳定性的研究。方法选用Ca2＋和凝血活酶联合激活系统激活、DEAESephadex A-50吸附法等技术提取出粗凝血酶，采用离子交换层析法，从粗凝血酶中纯化得到凝血酶纯品，对两者纯化效果进行比较。结果优化后的工艺比原生产工艺有明显提高。结论优化工艺应把生产凝血酶时温度控制在25℃，pH＝7，从猪血浆的吸附到凝血酶半成品，应在4 h内完成，这样才能获得较高纯度的凝血酶。

凝血酶；猪血浆；工艺；优化

血浆中凝血酶是近年来开发的一种新型止血剂。生产工艺多以新鲜猪血为原料，采用离心、Ca2＋单一因子激活系统激活、等电点沉淀法或724树脂吸附法等技术提取出粗凝血酶，采用亲和层析法，从粗凝血酶中纯化得到凝血酶纯品。但这种生产工艺提取收率低，工艺复杂，产品纯度不高等。故有必要进行凝血酶工艺优化。

1 实验方法

1.1 猪血浆的制备 取新鲜猪血加入3.8%的柠檬酸钠作为抗凝剂，在7 000 r／min下4℃离心20 min，收集上清液，即得猪血浆，备用。凝血酶原的制备：比较3条制备路线。等电点沉淀法：猪血浆0.5 kg，以9倍的去离子水稀释，用2 mol／L醋酸调pH 5.1，4℃静止过夜，收集沉淀，该沉淀用缓冲液溶解，去除沉淀，即获得凝血酶原粗样品液。724树脂吸附法：猪血浆0.5 kg，将处理好的724树脂适量加入，搅拌45 min，静止30 min。抽滤得到吸附剂，然后用1.5 mol的氯化钠溶液300 mL常温浸泡60 min，收集滤液。再用200 mL常温浸泡40 min，合并滤液。得到凝血酶原。DEAE-Sephadex A-50 吸附法：猪血浆 0.5 kg，将处理好的DEAE-Sephadex A-50适量加入，搅拌45 min，静止30 min。抽滤收集吸附剂，然后用1.5 mol的氯化钠溶液300 mL常温浸泡60 min，收集滤液。再用200 mL常温浸泡40 min，合并滤液。得到凝血酶原。

1.2 凝血酶原活力检测 （1）凝血酶原激活：取中性凝血酶原液1 mL，加入 0.25 mol／L的 CaCl2溶液，使Ca2＋浓度达到 0.05 mol／L，常温放置 1 h。得待测凝血酶原粗样品液。（2）纤维蛋白原溶液的制备：取纤维蛋白原约30 mg，精密称定，用0.9%氯化钠溶液1.5 mL溶解加凝血酶0.1 mL（约3单位），快速摇匀，室温放置约1 h至完全凝固，取出凝固物，用水洗至洗出液加硝酸银试液不产生浑浊，在105℃干燥3 h，称取重量，计算纤维蛋白原中含凝固物的含量（%）。然后用0.9%氯化钠溶液制成含0.2%凝固物的纤维蛋白原溶液，用 0.05 mol／L磷酸氢二钠溶液或0.05 mol／L磷酸二氢钠溶液调节 pH 至 7.0 ～ 7.4，再用0.9%氯化钠溶液分别制成含0.1%凝固物的溶液，备用。（3）标准曲线的绘制：取凝血酶标准品，用0.9%的氯化钠溶液分别制成每毫升含 5.0，6.4，8.0，10.0 u的标准品溶液。另取内径1 cm，长10 cm的试管4支，各精密加入纤维蛋白原溶液0.9 mL，置（37±0.5）℃水浴中保温5 min，再分别精密量取上述4种浓度的标准品溶液各0.1 mL，迅速加入上述各试管中，立即计时，摇匀，置（37±0.5）℃水浴中，观察纤维蛋白的初凝时间，每种浓度测5次，平均值（5次测定之最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，否则重测）。标准品溶液的浓度应控制凝结时间在14～60 s为宜。在双对数坐标纸上，以每管中标准品实际效价（u）为横坐标，凝结时间（s）为纵坐标，绘制标准曲线。（4）酶活测定：取待测凝血酶样品液，按标准曲线绘制中的方法求出凝结时间平均值，在标准曲线上求得酶活单位数。通过对3条凝血酶原制备工艺得到的凝血酶原的活力测定来选择最佳的方案。

1.3 凝血酶原的激活 两套激活系统。以 Ca2＋单一因子激活系统激活凝血酶原实验。

1.3.1 Ca2＋浓度对凝血酶活力的影响 取猪凝血酶原样品液分成 6份，加入 0.2 mol／L的 CaCl2溶液，使Ca2＋分别达到 0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，1.0 mol／L 的终浓度，并在室温下放置1 h，分别测定凝血酶活力。

1.3.2 Ca2＋激活时间对凝血酶活力的影响 将含有0.05 mol／L Ca2＋的猪凝血酶样品液在室温下放置，依次在 0.5，1，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 h 取测定凝血酶活力。Ca2＋和兔脑粉联合激活系统激活凝血酶原实验：取中性凝血酶原样品液两份，一份加入预处理好的兔脑粉溶液和IMCaCl2溶液在37℃水浴中保温 30 min。得到凝血酶样品溶液；一份按 2.2.3.1项下得到的最佳激活参数进行激活得到凝血酶样品溶液。测定两溶液的活力。

1.4 凝血酶纯化方法研究 两种方法。

1.4.1 离子交换层析法 将凝血酶样品溶液上样到事先用 0.05 mol／L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE离了交换纤维素柱。经同样的缓冲液充分淋洗后，改用1 mol／L的氯化钠溶液洗脱，分部收集活性部分，为凝血酶纯品。

1.4.2 亲和层析法 将凝血酶样品溶液上样到事先用 0.05 mol／L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液平衡好的 HeparinSepharose 4B亲和层析柱（亲和层析柱制法见文献［1］）。经同样的缓冲液充分淋洗后，改用2 mol／L的氯化钠溶液洗脱，分部收集活性部分，为凝血酶纯品。

1.5 凝血酶稳定性的研究

1.5.1 热稳定性 将猪凝血酶溶液分别置于不同温度下，保温不同的时间，分别测定凝血酶的活力。根据文献［2］记载，凝血酶温度从0℃增加到40℃，活性变化不大，在40℃保温7 h，活力无明显下降，而保温27 h，活力下降84%。

1.5.2 pH对凝血酶活性的影响 分别取0.5 mL酶液，加入5 mL不同pH缓冲液当中，充分摇匀，然后测定各个pH中的酶活力。

1.5.3 温度对凝血酶活性的影响 将底物血浆和酶置于不同温度下保温5 min，然后测定酶活力。

1.5.4 凝血酶的贮藏稳定性 将酶溶液保存在－20℃冰箱中，每隔一定时间测定酶活力。

1.5.5 盐离子浓度对凝血酶稳定性的影响 取酶液0.5 mL，加入不同量的含 4 mol／L NaCl的 0.05 mol／L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液，使 NaCl浓度为 0.15，0.30，0.45，0.60，1.00，2.00 mol／L，用 0.05 mol／L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液补足体积为5 mL，室温放置3 h，测定各个浓度下的酶活力。

1.6 凝血酶稳定剂的研究 取具塞试管12支，对照组3支，实验组9支。对照组：每支含1 000 u凝血酶的溶液50 mL。实验组：配制含甘氨酸0.15%和明胶0.10%的凝血酶溶液50 mL，酶活力1 000 u，分装入9支试管中，5 mL／支。

将上述试管在60℃下存放7 d，14 d，1月和2月，测定凝血酶活力，进行比较。

通过对不同pH的凝血酶纯品的凝血酶活力测定的数据，可以看出当pH＝7时，酶活力最稳定，而大于或小于7时，酶活力明显下降。

2 结果

凝血酶最佳制备工艺的确立：以新鲜的猪血浆为原料，经两次DEAE-Sephadex A-50吸附法吸附，然后用Ca2＋和凝血活酶联合激活系统进行激活，再通过离子交换层析法进行纯化，所得凝血酶半成品用LGJ 0.5冷冻干燥机进行冻干，经8 h冻干后即得凝血酶成品。

3 结论

生产凝血酶时温度要控制在25℃，用0.05 mol／L磷酸二氢钠溶液调节pH＝7，从猪血浆的吸附到凝血酶半成品，应在4 h内完成，这样才能获得较高纯度的凝血酶。

［1］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005（1）：1056-1057.

［2］陆茂林.凝血酶制备工艺的研究［J］.中国生化药物杂志，2002（3）：151-152.

［3］史进元.凝血酶稳定性的实验研究［J］.中国生化药物杂志，1999（6）：296-297.

R283.6

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1007－4813（2010）06－0961－02

2010－ 10－09）