HPLC法测定德欧血脂平胶囊中薯蓣皂苷元的含量

王继彦,位 鸿,王 蔚,高红梅,关树光,王 沛

(长春中医药大学,吉林长春130117)

高血脂和动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的生化和病理学基础,因此,降血脂和抗动脉粥样硬化症药物的研究一直受到人们的重视。天然甾体化合物具有降血脂作用已有报道[1-2]。德欧血脂平胶囊是以从薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino根茎中提取的有效成分薯蓣皂苷元(diosgenin)为原料制成的中药一类胶囊制剂,具祛痰降浊,活血通络等功效。临床用于高脂血症、动脉粥样硬化症的治疗。笔者在新药开发研制过程中,为了有效的控制原料及成品质量,建立了有效成分薯蓣皂苷元的高效液相色谱测定方法。

1 仪器与材料

日本SHIMADZU LC-10AT高效液相色谱,RID-10A示差检测器(RIU/FS=1×10-6),WDL-95色谱工作站。甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。薯蓣皂苷元对照品购自美国SIGMA公司,批号101H7711,纯度为98.68%。德欧血脂平胶囊成品由长春中医药大学附属医院新药研究中心提供。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件 色谱柱:LUNA SILICA(4.6 mm ×150 mm,5 μ m,Phenomenex公司),流动相:正己烷-醋酸乙酯(88∶12);体积流量:1.0 mL/min;柱温: 25℃;检测器:RID-10A示差检测器(RIU/FS=1× 10-6)。

2.2 对照品溶液的制备 取经80℃干燥至恒重的薯蓣皂苷元对照品约250 mg,精密称定,置25 mL量瓶中,加氯仿稀释至刻度,摇匀,即得(每1 mL中约含薯蓣皂苷元10 mg)。

2.3 原料药供试品溶液的制备 精密称取经80℃干燥至恒重的本品适量,加氯仿溶解并稀释制成每1 mL中约含本品10 mg的溶液,摇匀,即得。

2.4 制剂供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物,混合均匀,经80℃干燥至恒重后,精密称取适量,加氯仿溶解并稀释制成每1 mL中约含本品10 mg的溶液,摇匀,即得。

2.5 线性关系的考察 精密称取经80℃干燥至恒重的薯蓣皂苷元对照品500 mg,置50 mL量瓶中,加氯仿稀释至刻度,精密吸取对照品溶液1.25,2.50, 3.75,5.00,6.25,7.50,10.00 mL分别置10 mL量瓶中,加氯仿稀释至刻度。按上述色谱条件各进样20 μ L测定峰面积,以进样量对相应峰面积进行线性回归,计算得回归方程:Y=404 9X-3.526×103,r= 0.999 8。表明薯蓣皂苷元在25～200 μ g范围内有良好的线性关系。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液,分别于0,2,4,6, 8,10 h进样,计录峰面积。结果供试品峰面积 RSD为1.17%(n=6)。表明供试品溶液在10 h内稳定。2.7 精密度试验 取供试品溶液,连续进样6次测定,结果峰面积RSD为1.0%(n=6)。

2.8 重现性试验 取同一批样品(批号980210)6份,制备供试品溶液,依上述方法进行6次测定,结果薯蓣皂苷元质量分数的RSD为0.65%(n=6)。

2.9 回收率试验 采用加样回收法。精密称取已知薯蓣皂苷元含量为94.11%(6次测定平均值)的原料药(批号980210)5份,每份约100 mg,分别精密添加约100 mg的薯蓣皂苷元对照品,同样方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样,测定峰面积,计算回收率。结果薯蓣皂苷元的平均回收率为 101.2%, RSD=1.9(n=6)。

2.10 样品测定 取原料药薯蓣皂苷元及德欧血脂平胶囊成品(6批),分别制备原料药及成品供试品溶液,按上述色谱条件进行分析,根据外标法测定计算薯蓣皂苷元的含量(图略)。6批原料药中薯蓣皂苷元的质量分数分别为 0.927,0.942,0.926,0.959, 0.941,0.960 g/g;6批成品中薯蓣皂苷元的含量分别为198.1,198.0,202.6,205.5,205.4,202.6 mg/粒(标示含量分别为99.1%,99.0%,101.3%,102.8%, 102.7%,101.3%)。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备的溶剂选择 由于本制剂属于中药新药分类一类药,为单体化合物,考虑到在含量测定时对杂质的控制,对样品的溶解度进行了测定试验。按《中国药典》2005年版一部凡例的标准规定所要求的方法对样品和薯蓣皂甙元对照品进行了溶解测定,通过用氯仿、苯、醋酸乙酯、乙醇、甲醇等试剂溶解进行比较,结果用氯仿溶解的效果最佳。

3.2 色谱条件的选择 本测定方法采用的色谱条件是根据上述样品的溶解性并在参考文献的基础上经实验改进后所确定。薯蓣皂苷元分子结构中虽然有一双键,但仅在紫外末端有弱的吸收,文献报道有采用示差检测器[3]或紫外、ELSD法等检测器[4-6]进行检测,根据本制剂的具体情况,经比较实验采用了示差检测器;经比较了多种色谱柱后选择了硅胶柱;流动相为[石油醚(b.p.60～80℃)-异丙醇(12∶1)]。考虑到石油醚为混合物具不稳定性,因而没有采用文献的流动相。试验中曾以正己烷-异丙醇(98∶2);正己烷-醋酸乙酯(80∶20)等条件进行试验,但结果以正己烷-醋酸乙酯(88∶12)为佳。

3.3 测定结果 本方法简便快速,结果准确可靠,可为德欧血脂平胶囊的质量控制及薯蓣皂苷元的含量测定提供可行的方法。

[1]Cayen MN,Ferdinandi ES,Greselin E,et al.Studies on the disposition of diosgenin in rats,dogs,monkeys and man[J]. Atherosclerosis,1979,33:71.

[2]Sauvaire Y,Ribes G,Baccou JC,et al.Implication of steroid saponins and sapogenins in the hypocholesterolemic effect off fenugreek[J].Lipids,1991,26(3):191-197.

[3]S.B.Mahato,N.P.Sahu,S.K.roy,et al.High-performance liquid chromatographic method for the determination of diosgenin in plants[J].Journal of Chromatography,1981,206:169-173.

[4]沈娟,武向峰,朱臻宇,等.RP-HPLC法测定金刚藤软胶囊中薯蓣皂苷元的含量[J].中药新药与临床药理,2005,16 (6):438-440.

[5]黄嗣航,唐健新,黄苑红,等.高效液相色谱法测定金刚藤浸膏中薯蓣皂苷元的含量[J].中医药导报,2008,14(2): 69-70,75.

[6]付辉政,万凯化,刘敏.HPLC-ELSD法测定抗病毒分散片中薯蓣皂苷元的含量[J].中药新药与临床药理,2008,19(5): 380-381.