抑制STAT3表达增加H2O2诱导人胶质瘤U251细胞损伤

苏 静,孙际童,刘 宁,钟加滕,刘 菲,于慧美,康劲松

(吉林大学白求恩医学院病理生理学系,吉林长春130021)

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,基因突变导致的细胞周期失控及抗凋亡能力增加是其发生的主要原因[1]。神经胶质瘤恶性程度高,预后差,传统的放疗、化疗及手术治疗在内的综合疗法均不能解决肿瘤的恶化转移问题。信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)具有诱导细胞增殖和抑制凋亡的作用,作为Janus激酶(Janus kinase,JAK)-STAT途径中JAK激酶的底物,STAT3的酪氨酸残基被磷酸化形成二聚体入核后启动基因转录在细胞因子(cytokine,CK)的信号转导中起着关键性的作用[2]。已有研究证明,在多种肿瘤包括胶质瘤中,STAT3及其下游基因包括cyclinD1、c-Myc、Bcl-2和VEGF等常显示异常表达或活性增强[3]。RNA干扰(RNAi)是一种转录后的基因沉默。它能触发某种转录后监控程序,导致特异的 mRNA单链降解[4]。本实验利用pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒有效抑制人胶质瘤U251细胞STAT3蛋白表达,并观察其对氧化应激诱导的U251细胞损伤作用的影响,希望为胶质瘤临床治疗提供新的理论基础和实践依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人胶质瘤U251细胞和大肠埃希菌JM109由吉林大学白求恩医学院病理生理学系提供;带有U6启动子的质粒载体(pSilencer-1.0-U6)购自美国Ambion公司;新生小牛血清、IMDM培养基购自Hyclone公司;胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、APAⅠ、EcoRⅡ和H indⅢ限制性内切酶、质粒提取试剂盒、RTPCR相关试剂及寡核苷酸合成均购自Takara公司;STAT3、pSTAT3、Bcl-2、Bax、β-actin 抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗均购自Santa Cruz公司;脂质体(lipofectamine2000)、Trizol试剂购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3构建及鉴定根据genebank(NM 31500)人STAT3基因mRNA的已知序列和本实验室前期工作,确定合适的靶位点(2143-2162)。寡核苷酸链序列:GCAGCAGCTGAACAACATG;siRNA模板:sense:5'-GAT CCG CAG CAG CTG AAC AAC ATG TTC AAG AGA CAT GTT GTT CAG CTG CTG CTT TTT TGG AAA-3';antisense:5'-AGC TTT TCC AAA AAA GCA GCA GCT GAA CAA CAT GTC TCT TGA ACA TGT TGT TCAGCT GCT GCG-3'。pSilencer1.0-U6经APAⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶线性化,在T4 DNA连接酶的作用下与退火后形成的双链结构连接,形成 pSilencer1.0-U6-siRNASTAT3重组质粒。

1.2.2 细胞培养及转染 将U251细胞(1×106个)分别接种于100 ml培养瓶中(10%小牛血清IMDM培养液,37℃,5%CO2),培养至80%-90%细胞融合。用无血清培养液洗3遍,将重组质粒pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3按脂质体(Lipofectamine 2000)使用说明操作,培养4 h后(无血清IMDM培养液,37℃,5%CO2),弃上清,加入含10%小牛血清培养液及给药后继续培养24小时,收集细胞备用。

1.2.3 实验分组及给药方法 实验共分4组,对照组:转染 pSilencer1.0-U6质粒;STAT3-SiRNA组:转染pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3质粒;H2O2组:转染pSilencer1.0-U6质粒4 h后加入H2O2(终浓度为1 mmol/L)给药 24 h;STAT3-SiRNA+H2O2组:转染pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3质粒4 h后加入H2O2(终浓度为1 mmol/L)给药24 h。

1.2.4 亚甲基四唑蓝(MTT)比色法检测细胞生存率 取对数生长的细胞接种于96孔培养板,按细胞数1×104/well种入细胞,待细胞长满孔底90%时按上述方法转染给药,每组设5复孔,实验结束前4 h加MTT(5 mg/ml)20 μ l/well,37 ℃孵育4 h后吸出所有液体加入二甲基亚砜(DMSO)150 μ l/well,室温孵育15 min,全自动酶标仪(波长570 nm)检测各孔的吸光度,计算细胞生存率。结果应用SPSS11.5进行统计学分析。

1.2.5 Western-blot检测蛋白表达 用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,Biofrad法蛋白定量,进行Westernblot分析:取30 μ g总蛋白上样,实验结果经天能凝胶成像系统摄像、进行灰度值分析。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡 U251细胞接种于预先放置盖玻片的24孔板中,按前述方法转染给药。实验结束时用冷PBS冲洗3次,冷4%中性多聚甲醛固定20 min,室温干燥过夜。干燥后盖玻片-20℃保存。按TUNEL使用说明书染色。荧光显微镜下成像,激发波长为450-500 nm,检测波长为515-565 nm(绿色荧光)。按说明书设立阴性对照。计算细胞凋亡率。每组重复3次。

1.2.7 统计学处理 采用SPSS 11.0软件分析。计量资料实验数据以均数±标准差(±s)表示。单变量配对资料之间的比较采用配对样本t检验。

2 结果

2.1 转染重组质粒pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3能够有效抑制STAT3在U251细胞中的表达

Western-blot结果显示,与对照组相比,STAT3-SiRNA组U251细胞STAT3蛋白表达明显下降,对结果进行灰度分析,蛋白表达降低53.7±6.2%(P＜0.05,n=3)(见图1)。

2.2 抑制STAT3表达对H2O2作用下U251细胞生存率的影响

MTT结果显示,与对照组相比,H2O2组细胞生存率为53.8±6.2%(P＜0.05,n=3);STAT3-SiRNA+H2O2组生存率为32.3±11.6%,明显低于对照组和H2O2组(P＜0.05,n=3)(见图2)。

2.3 TUNEL法检测抑制STAT3表达对H2O2作用下U251细胞凋亡的影响

使用TUNEL法检测抑制STAT3表达和H2O2作用引起U251细胞发生凋亡的情况。荧光显微镜下观察,细胞核呈绿色荧光为凋亡阳性细胞。TUNEL结果显示:与对照组相比,H2O2组细胞凋亡率(17.0±4.3%)明显增加(P＜0.05,n=3);STAT3-SiRNA+H2O2组细胞凋亡率(27.8±8.6%)明显高于H2O2组(P＜0.05,n=3)。

2.4 凋亡相关蛋白BCL-2和BAX表达变化

Western-blot结果显示,与对照组(1.0±0.08)相比,H2O2组BCL-2与BAX蛋白表达之比(0.56±0.11)明显降低(P＜0.05,n=3);与H2O2组相比,STAT3-SiRNA+H2O2组BCL-2与BAX蛋白表达之比(0.32±0.14)明显降低(P＜0.05,n=3)(见图3)。

图1 STAT3-SiRNA重组质粒对U251细胞STAT3蛋白表达的影响

图2 抑制STAT3表达对H2O2作用下U251细胞生存率的影响

图3 抑制STAT3表达对H2O2作用下U251细胞凋亡相关蛋白BCL-2和BAX表达的影响

3 讨论

活性氧H2O2是体内氧化代谢的中间产物,易通过细胞膜产生细胞毒性,引起细胞氧化应激损伤和细胞死亡,常用于复制细胞氧化损伤模型[5]。STAT3可被多种细胞因子和生长因子激活,在胚胎发生和早期发育过程中具有不同的功能。在肿瘤发生过程中,常存在由蛋白酪氨酸激酶(PTKs)异常激活导致的STAT3的异常活化[6]。近来研究发现,在多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和头颈部肿瘤中STAT3持续激活[3]。利用反义寡核苷酸抑制STAT3表达或STAT信号转导通道抑制剂,均能降低细胞生存率,诱导凋亡发生。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种转录后的基因沉默,能够触发某种转录后监控程序,导致特定mRNA单链降解,调控特定基因的表达[4]。我们利用RNAi技术特异性抑制STAT3表达,观察其对氧化应激损伤U251细胞的影响。实验结果显示,我们设计构建合成的pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒体外转染U251细胞,能够有效抑制STAT3蛋白表达(抑制率＞50%)。有效抑制STAT3表达能降低U251细胞生存率、增加细胞凋亡率,同时降低凋亡相关蛋白BCL-2和BAX表达比值。氧化应激损伤U251细胞模型中,抑制STAT3表达,进一步降低细胞生存率,增加细胞凋亡,使BCL-2和BAX表达比值降低。最近的研究已经证实STAT3在神经胶质瘤和神经胶质瘤细胞系都存在异常持续性激活,在神经胶质瘤的增殖、分化和进展过程中具有重要的作用[3]。在我们的研究工作中,得到如下结论:有效抑制STAT3表达能降低神经胶质瘤细胞生存率,并增加其对氧化应激损伤的敏感性。

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