显齿蛇葡萄(藤茶)愈伤组织培养的研究

周 耀 李思长 刘 毓 王双双

（湖南农业大学·长沙·410128）

显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)为葡萄科、蛇葡萄属木质藤本植物,主要分布于广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省区[1],为民间习用草药之一。据记载[2],该药性凉,味甘淡,具有清热解毒之功效,主治黄疸型病毒性肝炎、风热感冒、咽喉肿痛、痈疮等症。显齿蛇葡萄的愈伤组织诱导少见报道。本文以显齿蛇葡萄不同的部位为外植体,研究其在不同基本培养基、植物生长调节剂以及培养条件下愈伤组织的诱导效应,确定愈伤组织诱导和增殖的最适培养基及培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料

引种自湖南绥宁县。选取健壮植株中上部外围生长旺盛的幼茎作为供试材料。

1.1.1 外植体的选取

茎尖：取3cm左右长的带顶芽茎段,在解剖镜下逐层去除幼叶,切取0.12～0.13mm左右大小的茎尖分生组织。

带芽茎段：将发育良好的幼嫩茎段去除顶芽与叶片,切成长约1cm的带芽茎段。

叶片:选取黄绿色幼叶,去除幼叶边缘,切成1cm2左右的小块。

叶柄：选取较幼嫩的成熟叶片的叶柄,顶端带少量叶片,长约1cm。

1.1.2 继代培养材料的选取

生长良好的初代愈伤组织。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

以MS、B5为基本培养基，添加不同浓度的2，4-D，6-BA，NAA，KT 等植物生长调节剂，并添加不同浓渡的椰子汁、蔗糖，pH值为5.8～6.0。

继代培养基：不同浓度梯度的NAA与2，4-D组合。

1.2.2 外植体的消毒、接种与培养条件

流水冲洗幼枝2～3h,洗净后在超净工作台上用70%酒精快速处理30s，用无菌水冲洗一次，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡：嫩叶浸泡 5min，茎段、叶柄浸泡7～8min，无菌水冲洗多次；接种在不同的培养基上；培养条件：温度为25℃～26℃，光照强度开始为 250～300Lx、 后转为 2000～3000Lx， 光照时间（14h/d）,相对湿度为 75%～85%。

2 研究内容

①不同培养基愈伤组织的诱导；②不同外植体愈伤组织的诱导；③叶片正、背面朝上对愈伤组织的诱导；④不同光照强度下愈伤组织的诱导；⑤不同光照时间愈伤组织的诱导；⑥添加不同椰子汁用量愈伤组织的诱导；⑦不同植物生长调节剂浓度组合的愈伤组织诱导；⑧不同植物生长调节剂组合的继代培养。

3 结果与分析

3.1 不同培养基对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响

将显齿蛇葡萄幼叶接种在含有2，4-D 2mg/L+KT0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖2%+琼脂0.7%的不同基本培养基上（MS、B5），每种处理10瓶，每瓶外植体5块，培养15d，观察统计出愈率与愈伤生长情况（表1）。

从表1可知，MS培养基对显齿蛇葡萄幼叶愈伤组织的出愈率最高（90%）、长势好，B5培养基的出愈率最低（65%）、生长情况也最差。

MS培养基中无机盐的浓渡高，能满足愈伤组织对矿物质营养的要求，愈伤组织生长快，同时铵盐和销酸盐的含量高，且比例适合，不需要添加更多的有机附加物；改良MS培养基是在MS培养基的配方中把无机盐的含量减少了一半配制而成，出愈率及愈伤生长自然隆低；铵可能对不少培养物的生长有抑制作用，B5中铵盐浓度较低，可能反而较大地限制了显齿蛇葡萄愈伤的形成和生长。

表1 不同基本培养基对愈伤组织的影响Table 1 The effect on callus induction ofdifferent basic media

3.2 不同外植体愈伤诱导效果比较

将不同外植体（叶片、叶柄、茎段和茎尖）分别接种在 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰子汁+蔗糖2%+琼脂0.7%的培养基上培养，每种处理10瓶，7～12d外植体开始萌动，并随后产生愈伤组织，结果见表2。

表2 不同外植体的愈伤诱导效果比较Table 2 The induction ofcallus from different explant

从表2可知，叶片外植体的出愈率高达93%，要明显高于叶柄的（85.7%）和茎段的（81.2%），且愈伤生长状况较好。

叶片外植体出愈率高的原因可能是因为幼嫩叶片的细胞分化程度较低，因而具有较大的脱分化潜力；且与培养基接触面积大，对添加的植物生长调节剂更为敏感。茎尖外植体未见愈伤产生，可能有两个原因：一是试验操作有误，如茎尖剥离时去掉了顶端分生组织；二是因为取材时间是秋天，已近休眠时间。

3.3 叶片正背面朝上对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响

将切好的叶片以正面朝上和背面朝上，分别接种于 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰子汁+蔗糖2%+琼脂0.7%的培养基上，每处理5瓶，弱光培养15d，结果见表3。

表3 叶片正背面朝上对愈伤组织诱导的影响Table 3 The effect on callus induction ofleafin different side

由表3可知，正面朝上叶片的出愈率为93.3%，明显高于背面朝上的（60%）处理，且启动时间短。这可能与叶片的结构有关。显齿蛇葡萄正面朝上，叶片背面气孔较多，且靠近疏松的海绵组织，利于吸收，因此叶片背面接触培养基培养更为适宜。同时还发现，叶片背面朝上接种产生的愈伤组织褐色较明显。

3.4 光照强度对齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响

将接种的叶片在25℃恒温培养室进行光照强度分组试验，设以下三种光照强度：①2000～2500Lx：每层培养架用4支40W日光灯照明，直射光；②1000～1250Lx：每层培养架用2支40W日光灯照明，直射光；③250～350Lx：放在另外一层不开灯的架子上，仅靠旁边培养架上的散射光。20d后统计结果（表4）。

表4 不同光照强度对愈伤组织诱导的影响Table 4 The effect on callus induction of different light intensity

由表4可知，光照强度对显齿蛇葡萄叶片愈伤组织诱导效果的影响较显著：在暗培养下，愈伤诱导率最高（94.2%），但愈伤质地疏松；在弱光（250～350Lx）下出愈率最高达92.5%，愈伤呈浅绿色，质地致密，质量好；当光强达2000～2500Lx时，出愈率急剧下隆至52%，且质地疏松。因此，显齿蛇葡萄愈伤诱导以弱光诱导为最佳。

3.5 光照时间对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响

将叶片接种在MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖2%+琼脂0.7%的培养基上，在培养温度25℃、光照强度250～350Lx、培养瓶中叶片距光源约400mm的条件下，设置光照时间梯度 10h/d、12h/d、14h/d 和 16h/d， 每处理 13 瓶，15d后统计结果（表5）。

表5 不同光照时间对愈伤组织诱导的影响Table 5 The effect on callus induction ofdifferent illumination time

由表5可见，光照时间为14h/d时外植体出愈率最高，同时愈伤生长状况最好；随着光照时间缩短，出愈率下降较明显；但光照时间高达16h/d时，则容易出现愈伤褐化现象。综合表4和表5发现，较长时间弱光条件利于显齿蛇葡萄叶片愈伤的诱导，可能是因为可诱导愈伤形成的植物激素的产生依赖于光的存在[4]。

3.6 椰子汁用量对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响

培养基中加入椰子汁，常能有效提高愈伤组织诱导率。将切好的叶片接种在MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖2%+琼脂0.7%的培养基上，依次调节椰子汁的用量，每处理3瓶，15 d后统计愈伤组织诱导结果（表6）。

表6 不同椰子汁用量对愈伤组织诱导的影响Table 6 The effectoncallus inductionofcoconutmilk concentration

从表6可看出，椰子汁用量为100ml/L时为最合适用量，该处理的出愈率最高，用量过多或过少时，出愈率均有所下降。

3.7 不同植物生长调节剂浓度组合对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响

在获得最佳培养基上，以嫩叶为外植体，设置4 个因素分别为 6-BA、2，4-D、NAA、KT 根据 5 因素 4 水平设计 L16（54）（表7），15d 后统计愈伤组织诱导结果，正交试验[5～7]，结果见表8。

表7 正交因素表Table 7 The table of orthogonal experiment

表8 正交试验结果Table 8 The results of orthogonal experiment

从表8中可看出，通过正交实验得出植物生长调节剂影响因子排序为：6-BA〉KT〉NAA〉2，4-D；最佳组合为 6-BA （1.5mg/L）+KT(0.15mg/L)+NAA(0.2mg/L)+2，4-D（2mg/L）。将最佳实验组合重复实验3次，与正交实验结果一致。同时发现高浓度的6-BA容易导致愈伤出现褐化现象。

3.8 不同植物生长调节剂组合对显齿蛇葡萄继代培养的影响

在获得初代培养最佳基本培养基上，生长良好的初代愈伤作为继代培养的材料，以MS为基本培养基，分别设置不同的植物生长调节剂NAA和2，4-D的组合，添加100ml/L椰子汁+蔗糖2%+琼脂0.7%，试验重复三次。继代培养15d天后，统计试验结果（表9）。

愈伤组织继代培养所用的植物生长调节剂最佳组合为：1.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D。继代培养出的愈伤组织呈团块状，黄绿色，结构较致密，增殖率较高。

据报道[8]，培养物褐变是由于培养物含有的丰富多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧化所致，在培养基中加入抗氧化剂，对防止某些植物培养物的褐变具有一定的效果。

表9 不同植物生长调节剂组合对继代培养的影响Table 9 The effect on genetated culture of different hormone combination

3 结论

显齿蛇葡萄以叶片为外植体诱导愈伤组织明显优于其它外植体，且以叶片正面向上为佳。经过单因素试验和正交试验得出最佳的培养条件是：在培养基MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L KT+0.2mg/L NAA+2mg/L 2,4-D+100ml/L椰子汁上，光照强度为250～350Lx，每日光照时间为14h，出愈率最高，且愈伤组织生长状况最好。

1 中国科学院植物研究所，中国高等植物图鉴（二册）补编[M].北京：科学出版社，1883：349～356.

2 郑小红，刘金龙，向班贵，等.显齿蛇葡萄新品种——绿凤[J].园艺学报，2004，31（5）：701

3 杜和平.开封菊花的部分品种的外植体再生体系的研究 [J].现代农业科学，2009，16（7）：19～20.

4 HARTMANN F.uberdiaWirkungdesPhytochromsBeim.Laubmooskal-lus.I.Photomorphogenese und Stoffwechsel[J].Beitr,Biopfl cmzeu,1973,49:1～34.

5 张恒基，柏新富，刘林德，等.芫花愈伤组织的分化与植株再生[J]林业科技，2009，34（4）：78～81.

6 胡长玉，张霄雯.柳叶蜡梅叶片愈伤组织诱导实验研究[J].中国林副特产，2009，108（4）：11～12.

7 柴 淳，黎云祥，陈光登，等.白勒愈伤组织培养条件优化及总黄酮含量测定[J].光谱实验室，2009，26（4）：939～943.

8 周仁超，姚崇怀.紫斑牡丹胚培养与植株再生[J].亚热带植物科学，2001，30（3）：601