辣椒愈伤组织辐射诱变及离体再生培养的研究

王 迅，洪亚辉

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科类蔬菜，含有丰富的维生素C，是日常食物的调料品[1]。近些年辣椒病害发生严重，对农民造成越来越大的经济损失。通过改造基因来培育辣椒抗病品种越来越受到重视[2]。同时，组织、细胞及原生质体培养方面的研究迅速发展，诱变与组织培养相结合，对增加遗传变异率、减少育种时间和改进育种技术将具有很大潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为株洲醴陵的玻璃牛角椒。

1.2 方法

1.2.1 辣椒植株再生体系建立 （1）无菌苗的培养。将精选种子用清水浸泡 8～12 h，1%升汞消毒10 min，无菌水清洗 3～5次，播种于MS培养基中，置于暗处萌发。待胚根露出后转入人工气候箱中培育壮苗。培养条件：白天 26℃，夜晚 20℃，光照14 h/d，光强 2 000～2 500 Lx。

（2）愈伤组织的诱导。待无菌苗长到3～4 cm，取无菌苗在超净工作台上将其子叶切下，再切成2～3段，并在非截面边切下1 mm左右的边（目的是产生更多的创伤面）。将切好的子叶转入不同激素配比的愈伤诱导培养基中，在光照培养箱中培养，设光照16 h，昼温度27℃，夜温度24℃。培养基主要成分是MS的基础培养基，为了筛选出最适的愈伤组织诱导培养基，在参考了其它文献后决定共用3种激素：6-BA，KT，IAA，设立 12 种配比，分别用辣椒的茎和子叶来作为外植体诱导愈伤组织生长。经过20 d的培养后观察，统计愈伤组织的生长状况。

（3）不定芽与不定根的诱导。待幼芽长至2～3 cm后，取其子叶根据长度切成2～3段，近轴面朝上接种于诱芽培养基中，置于人工气候箱培养，20 d后统计不定芽诱导情况。待不定芽长出 0.5～1 cm的叶子后将幼芽自基部切下，插入生根培养基上进行培养。通过添加不同浓度的IAA、IBA和NAA组合来筛选最佳培养基，20 d后统计不定芽的生根情况，确定最适的生根培养基。待苗长出较发达的不定根系并有 3～5 cm高后，打开瓶盖炼苗48 h。然后洗净苗根部的残余培养基，移植到灭菌土中。

1.2.2 辐射诱变处理 辐射设3个梯度，剂量分别为 20、40、60 Gy。以未经辐射处理的材料为空白对照。60Co-γ射线处理由湖南省原子能农业应用所完成。

（1）辐射后再生植株染色体观察。待移栽的再生苗生长到8～10 cm高后对其进行形态学及细胞学观察。取诱变后植株的根尖，每个剂量处理取5个以上植株，每个植株取3个以上的根尖，将根尖剪下于卡诺氏液（冰乙酸1份，无水乙醇3份）中固定2～4 h。如需长时间保存，则将固定好的根尖保持在体积分数为70%的酒精中置于冰箱内4℃存放。固定后的根尖经体积分数为70%的酒精处理后，转入蒸馏水中漂洗5～6遍，洗去根尖表皮细胞上附着的酒精，使着色更加充分，在预热60℃的1mol/L HCl中处理2～3min，冲洗5～6遍，卡宝品红染色 5 min，压片镜检，在光学显微镜（600×）下进行染色体数目的观察并计数。

（2）诱变后的再生培养。经辐射诱变的辣椒愈伤组织立即转入高营养MS培养基恢复生长，5 d后转入生芽培养基。待再生芽点长出0.5 cm2的叶子后，转入生根培养基。待苗长出较发达的不定根系并有 3～5 cm高后，打开瓶盖炼苗48 h。然后洗净苗根部的残余培养基，移植到灭菌土中。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对辣椒愈伤组织诱导的影响

经过20 d的培养后观察，统计了愈伤组织的生长状况，发现子叶和茎都能很好的诱导出愈伤组织，但6-BA的效果比KT普遍要好。其中子叶以3～5 mg/L的6-BA加0.5 mg/L的IAA诱导率最高，而茎在7 mg/L的6-BA加0.5 mg/L的IAA诱导率最高。

2.2 不同激素配比对辣椒外植体再生分化的影响

从试验结果可以看出，用苗龄10 d左右辣椒子叶作为外植体来诱导再生植株，其芽分化和根分化能力均比较高，茎诱导分化不定根的能力比子叶要强，但诱导分化不定芽的能力很低。用MS培养基添加3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO3诱导不定芽再生的效果最好，其中加入的硝酸银能够显著提高芽分化率，与未加硝酸银的相比，分化率可提高30%以上，并大大缩短分化时间（表1）。但过高浓度的硝酸银会造成植株茎叶畸形[3-5]，经筛选，以3～4 mg/L的硝酸银浓度最为合适。

表1 不同激素组合对不定芽诱导的影响

用愈伤组织诱导再生根是以MS基础培养基添加0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA诱导不定根的分化效果最好，分化率达73.5%左右；在根的分化方面，由茎诱导的愈伤组织比子叶诱导的愈伤组织具有更强的分化能力（表2）。

表2 不同激素组合诱导再生根的影响

2.3 不同辐射剂量下再生植株的染色体变异分析

通过显微压片技术对辐照后的辣椒再生植株进行染色体观察并计数，发现染色体数目出现了不同程度的变异。随着辐射剂量的增加，细胞染色体损伤也随之加重，通过对再生苗的不定根做根尖染色体染色压片，在显微镜下可观察到有丝分裂时出现的连桥（图1）。

2.4 不同辐射剂量对外植体再生分化的影响

在辣椒愈伤组织经不同剂量的60Co-γ照射处理后，不同程度的表现出生长受到抑制，分化减缓，分化率降低，甚至褐化死亡的现象。辐射剂量越高，成活率越低，恢复生长分化所需时间越长，分化率越低。在20 Gy剂量下分化能力明显降低，但在两周后大部分开始恢复生长，30 d后有小部分出现新的芽点。在40 Gy和60 Gy下基本停止分化，一周后，边缘开始变黑，20 d后整体开始褐化，30 d后基本死亡。适当的更换新鲜培养基可以延缓褐化过程，但对提高分化率没有明显效果。这表明用愈伤组织作为辐射材料相对于用种子作为辐射材料的辐射剂量要有所控制。剂量过高辐照后无法存活，而剂量太低则得不到足够多的变异。为了进一步提高愈伤组织的存活率，而又保证一定量的变异发生，试验尝试了提高培养基的含糖量，取得了一定的效果，使得最终存活率达到了50%以上（表3）。根据半致死剂量是表示辐射育种适宜诱变剂量的标准[4]，可以认为20 Gy的吸收剂量是辣椒愈伤组织诱变处理较为适合的剂量。

图1 辐射后有丝分裂中出现的连桥现象

表3 各个辐射剂量下愈伤组织的存活率

从试验可以看出，诱导不定芽再生的效果经过辐射处理的愈伤组织，其分化能力也受到很大影响，不定芽和不定根的分化能力随着辐射剂量的提高骤减；40 Gy以上的剂量使得愈伤组织基本失去分化能力，而对于已分化出芽的愈伤组织其根分化能力依然很强；在60 Gy的辐射剂量下，几乎丧失分化能力，仅能维持几周的生长时间（表4）。但适当的提高AgNO3的浓度对提高分化不定芽有一定的帮助。

表4 不同辐射剂量对愈伤组织诱导芽和根的影响

图2 辐射对辣椒愈伤组织再生的影响

3 讨论

要构建离体培养体系，筛选合适的激素组合是至关重要的。用无菌苗子叶作为外植体，反复筛选激素配方，构建较为高效的辣椒离体再生培养体系。一些研究者认为6-BA能有效促进不定芽的分化，但本研究发现仅添加6-BA对芽的诱导作用不大，与IAA按一定比例添加则可提高芽的诱导分化率，这表明不同辣椒品种对激素产生的效应不同。AgNO3能够显著促进芽的分化，添加浓度越高，不定芽的诱导率也越高，不过高浓度的AgNO3会造成植株生长畸形，这与贺晓庆[6]等的结论吻合。但本研究还发现，AgNO3能造成植株分叉增多、花期提前，这有利于提高辣椒产量，值得进一步研究。

[1] 陈文超.湖南辣椒发展状况[J].辣椒杂志，2007，（2）：8-9.

[2] 马艳青，张西露.湖南辣椒产业现状及发展思考[J].湖南农业科学，2009，（12）：56-60.

[3] 邱 萃，何水林.辣椒组织培养再生体系的建立与应用[J].亚热带农业研究，2006，（2）:304-308.

[4] 詹亚光，唐敬轩，齐凤慧.60Co-γ诱变对白桦愈伤组织再生的影响及再生植株染色体数量变异分析 [J].东北林业大学学报，2008，（1）:16-17.

[5] 黄 炜，巩振辉.辣椒立体再生体系研究 [J].中国农学通报，2005，（12）:270-272.

[6] 贺晓庆，巩振辉.不同辣椒材料离体再生及其影响因素的研究[J].西北植物学报，2007，27（7）：1329-1334.