苏云金芽孢杆菌cry1Ac28基因的克隆及原核表达

曲步云，李海涛，李 明，高继国

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它广泛分布于世界各地，从热带雨林到北极冻土带。已经从许多材料上分离获得该菌，如土壤、植物叶片、鲜水[1]、粪便[2]、动物活体[3]、食物、仓储等，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3 000多种害虫有活性[4]。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），也称 δ-内毒素（Deltaendotoxin），它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[5]。该杀虫晶体蛋白分别由cry和cyt基因编码。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止目前至少已有447个ICPs基因被克隆和测序[6]。从Bt菌株中鉴定到的cry蛋白根据其氨基酸序列同源性的差异已多达59类（cry1～cry59）。因此，对杀虫晶体蛋白的挖掘及研究具有非常重要的实际价值。

本研究中Bt Q-12菌株分离自辽宁省鞍山市千山土壤，经过PCR-RFLP鉴定出的含有cry1类基因，成功克隆出了一段cry1Ac全长序列，构建重组表达载体导入大肠杆菌并诱导其高效表达。本研究为进一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本文所用菌株和质粒见表1。

表1 菌株与质粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培养基

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、加水定容至1 000 mL、pH 7.2、121℃、高压灭菌20 min。

LB固体培养基：LB液体培养基加入1.3%琼脂粉。

1.1.3 主要试剂

TaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶、dNTP（购自TaKaRa公司）；PCR引物（由上海生工公司合成），DNA凝胶回收试剂盒和DNA连接酶（购自上海生工公司）；其他药品均为国产分析纯以上产品。

1.2 方法

1.2.1 Bt Q-12菌株晶体形态的观察

将Bt Q-12菌株接种于LB固体培养基上，30℃培养72 h后，进行涂片、烘干固定，石碳酸复红染液染色3 min，清水冲洗，100倍油镜进行镜检。

1.2.2 Bt Q-12菌株生长曲线测定

将Bt Q-12菌株接种于5 mL液体LB培养基试管中30℃，230 r·min-1活化过夜，1%转接到LB液体培养基中，30℃，230 r·min-1培养，每隔2 h取1 mL菌液测OD600的吸光值，OD值大于1时稀释10倍测定。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制生长曲线图。

1.2.3 cry1Ac全长基因的PCR扩增

大肠杆菌质粒DNA的提取、DNA的酶切、连接、感受态的制备、转化和表达产物SDS-PAGE检测参照文献[7]进行。PCR产物回收和纯化参照上海生工PCR产物回收试剂盒说明书。PCR-RFLP体系鉴定Bt cry基因和阳性转化子的筛选参照宋福平等方法进行[8]。

根据Bt命名中心已公布的cry1Ac类基因的全长序列[9]，通过其同源性的比较，设计出用于扩增全长序列的引物。

上游引物（Q5unx）：5′CGCGGATCCATGGAT AACAATCCGAACATC3′（Bam HⅠ）

下游引物（Q3unx）：5′ACGCGTCGACCTATT CCTCCATAAGGAGTA3′（SalⅠ）

PCR热循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃聚合3 min，循环30次；72℃聚合10 min。取8 μL PCR产物于0.7%琼脂糖凝胶上电泳，检测PCR产物。

1.2.4 原核表达载体的构建

回收cry1Ac类基因的全长PCR产物，分别对PCR产物和pEB载体用Bam HⅠ和SalⅠ进行双酶切并回收，4℃连接过夜。将CaCl2法转化制备的感受态E.coli JM109，涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃、12 h，PCR鉴定及酶切分析，筛选出含cry1Ac基因的阳性重组质粒。

1.2.5 序列测定及分析

由上海生工生物工程有限公司完成序列测定，采用NCBI Balst、DNAMAN等软件分析序列。

1.2.6 cry1Ac基因的诱导表达

将获得的阳性重组质粒转化到感受态E.coli BL21（DE3）中，210 r·min-1、37 ℃培养至 OD600达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1进行诱导表达，37℃过夜培养，收集诱导培养物，离心收集沉淀。SDS-PAG检测表达产物。同时用0.5 mmol·L-1IPTG 诱导 BL21（DE3）空菌株和含 pEB 空载体的菌株、未诱导含pEB空载体的菌株作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 Bt Q-12菌株生物学特性的分析

2.1.1 Bt Q-12菌株伴胞晶体形态的观察

Bt Q-12在LB培养基中30℃培养48 h可见菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，边缘不整体。挑取单菌落少量，制片，油镜下观察，可见伴胞晶体形态为大小不一的菱形（见图1）。

由图1可知，伴胞晶体的形态因cry基因的不同而不同，因此，根据显微形态的观察，可以初步推测菌株所含基因类型，从而推测Bt Q-12菌株含有cry1类基因。

2.1.2 Bt Q-12菌株生长曲线测定

菌株Bt Q-12的生长曲线如图2所示，在2～6 h处于对数生长期，14～18 h进入生长稳定期，稳定期的OD600值约为3.5，与其他Bt菌株相比没有太大差别。

图1 Bt Q-12菌株的晶体形态Fig.1 Crystal shape of Bt Q-12

图2 菌株Bt Q-12的生长曲线Fig.2 Growth curve of Bt Q-12

2.2 Bt Q-12菌株cry基因类型的鉴定

对菌株Q-12进行基因型的PCR-RFLP鉴定，采用特异引物K5un2/K3un2获得了大小为1.6 kb的PCR产物（见图3）。将1.6 kb的PCR产物进行PstⅠ/XbaⅠ酶切，获得了cry1基因的RFLP图谱（见图4），从图4可以看出，扩增获得的1.6 kb PCR产物经酶切后产生了4个酶切片段，大小分别为1 117、802、518和322 bp。根据宋福平等的研究结果（见表2）[8]，说明其含有cry1Aa和cry1Aa基因。将PCR产物克隆至pMD18-T载体，通过K5un2/K3un2引物PCR筛选，得到阳性克隆子并测序。测序结果经NCBI Blast比对，确定该因核苷酸序列与cry1Aa最为相似，相似度为97%。

图3 pMD18-T-cry1Ac的酶切分析与PCR鉴定Fig.3 Restriction analysis and PCR detection of pMD18-T-cry1Ac

图4 Bt Q-12菌株cry1的PCR-RFLP酶切电泳检测Fig.4 PCR-RFLP detection of cry1 from Bt Q-12

表2 cry1类的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性Table 2 Size of PCR products and their PCR-RFLP patterns of cry1 genes

2.3 cry1Ac全长基因的克隆

用引物Q5unx/Q3unx扩增得到cry1Ac 3.5 kb的全长基因，用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切全长PCR产物和载体pEB，回收、连接、转化JM109，经抗性筛选、PCR鉴定及酶切分析，筛选出含基因的阳性重组质粒。图4为阳性重组质粒酶切分析及PCR鉴定结果，经Bam HⅠ和SalⅠ酶切后，得到大小为5.7 kb的载体条带和3.5 kb全长基因条带，说明该表达载体构建正确，该表达载体命名为pEB-cry1Ac。

2.4 cry1Ac全长序列及同源性分析

结果见图5、6。

图5 cry1Ac28蛋白的氨基酸组成Fig.5 Amino acids composition of cry1Ac28 protein

通过DNAMAN软件分析Bt菌株Q-12编码区长3537 bp。由DNA序列推导的氨基酸为1 178个，其中在其编码的蛋白质的氨基酸组成中，亲水性氨基酸占33.1%，疏水性氨基酸占43.0%，酸性氨基酸占12.9%，碱性氨基酸占11.0%。蛋白质的分子质量为 133.3176 ku，亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）三种氨基酸含量最高，分别为8.06%、7.80%和7.72%（见图5），等电点为4.885（见图6），为弱酸性蛋白质。该基因已在国际基因库GenBank中注册，登记号为FJ610439，并经Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ac 28。

图6 cry1Ac28蛋白滴定曲线Fig.6 Titration curve of cry1Ac28 protein

NCBI Blast比对该蛋白序列与其他cry1Ac基因氨基酸的差异见表3。cry1Ac28与其他cry1Ac基因比较，在结构域Ⅰ、结构域Ⅱ存在一些差异，结构域Ⅲ与大部分cry1Ac基因相同。其中与cry1Ac23差异最大，结构域Ⅰ存在9个差异，结构域Ⅱ存在8个差异，结构域Ⅲ存在4个差异。同时NCBI Conserved Domain Summary分析结果表明，该蛋白的DomainⅠ由N端第36～254位，共218氨基酸组成；DomainⅡ由第259～461位，共202个氨基酸组成；DomainⅢ由第470～608位，共138个氨基酸组成。因此，cry1Ac蛋白的活性区估计在N-端的36～608个氨基酸附近。

2.5 cry1Ac28基因在E.coli BL21(DE3)中的表达

将重组质粒pEB-cry1Ac转化到E.coli BL21（DE3）中，诱导表达，收集诱导物离心弃上清，SDS-PAGE（8%）。结果表明，含有pEB-cry1Ac的BL21（DE3）菌在130 ku处有一特异的蛋白带，与预期的分子质量一致，而经IPTG诱导的BL21（DE3）空菌株和含pEB空载体的菌株没有特异的目的带产生（见图7）。应用TANON公司凝胶定量软件GIS3.74分析，cry1Ac28的表达量占菌体总蛋白的18.2%。

表3 cry1Ac28与其他cry1Ac基因氨基酸差异比较Table 3 Comparison of amino acid sequence between cry1Ac28 and other cry1Ac

图7 cry1Ac28在BL21(DE3)中表达蛋白的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE protein which cry1Ac28 expressed in BL21(DE3)

3 讨论

自1985年Adang等首次从苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）HD73中克隆了第一个Bt cry1Ac基因（即新的命名系统中的cry1Ac1）以来[10]，国际上已有29个cry1Ac（cry1Ac1-29）基因被陆续克隆和测序。

本研究从实验室分离保存的苏云金芽孢杆菌分离株中选择Q-12野生菌株进行生物学特性鉴定，此野生菌株在LB培养基中产生的菱形晶体特别多，而且重复性强，菱形晶体蛋白对鳞翅目昆虫具有特异性，研究这菌株的生物学特性，对获得高毒性的杀鳞翅目的新的Bt菌株具有重要价值。

菌株的伴胞晶体形状与杀虫晶体蛋白的类型有关，cry1类杀虫晶体蛋白的伴胞晶体形状多为菱形，cry3类蛋白的杀虫晶体蛋白的伴胞晶体多为方形，而鞘翅目害虫蛴螬和双翅目害虫特异的cry8类蛋白的杀虫晶体蛋白的伴胞晶体多为球形[11]。由此可见，伴胞晶体的形态因cry基因的不同而不同，根据显微形态的观察，可以初步推测菌株所含基因类型。本试验首先通过镜检观察Q-12具有菱形伴胞晶体就可初步推测其含有cry1基因。因此，在对具有未知杀虫基因经进行鉴定之前，仔细分析菌株的杀虫蛋白晶体特点对其进一步研究极其重要。

该基因表达载体的构建是应用的多功能高效表达载体pEB。pEB是利用引物从克隆表达重组蛋白功能最强大的系统pETblue-2质粒上扩增出该质粒的表达区。目的基因被克隆到pEB质粒载体上，受噬菌体T7启动子强转录及翻译信号控制，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性，在IPTG充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。该载体的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。故在本试验中我们选择了pEB作为表达载体，研究结果表明cry1Ac28基因在pEB中能实现高效、稳定的表达。可见在做原核表达之前选择表达系统（受体菌和表达载体）非常重要。另外，在选择了合适表达载体的基础上，对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和摇床转速等条件进行优化后能提高目的蛋白的表达量。本试验之前在37℃条件下，可溶性蛋白极少，之后改变温度将诱导温度选择在20℃，降低IPTG浓度，延长诱导时间，并选择较低的摇床转速等。

对cry1Ac28蛋白的生物信息学分析研究揭示出了与其他已知的cry1Ac基因的氨基酸序列在结构域Ⅰ、结构域Ⅱ存在一些差异，结构域Ⅲ与大部分cry1Ac基因相同，说明来自不同国家和地区的菌株所含的同一亚类基因保守性较强。结构域Ⅰ位于杀虫晶体蛋白的N端是疏水的部分，具有α-螺旋结构，是发挥特异毒力的功能区域[12]。任羽等研究结果表明[13]，在结构域Ⅰ中的突变更容易产生活性提高的突变蛋白，而结构域Ⅱ和Ⅲ较难获得毒力提高的突变蛋白，由此可以预测cry1Ac28蛋白也可能是高毒力蛋白。进一步研究cry1Ac28蛋白的构象及杀虫活性，对扩大Bt菌株的杀虫谱、增强菌株毒力、构建高效广谱杀虫Bt工程菌均具有现实意义。

4 结论

本研究以本实验室分离的Bt菌株Q-12为研究对象，经过PCR-RFLP鉴定出的含有cry1类基因，设计可扩增出cry1Ac基因完整的开放阅读框（ORF）的引物对Q5unx和Q3unx，克隆得到cry1Ac全长基因。该基因编码区为3 537 bp，编码1 178个氨基酸，已正式被苏云金芽孢杆菌δ-内毒素命名委员会命名为cry1Ac28。成功构建了原核表达载体（pEB-cry1Ac），并实现了高效特异性蛋白表达，表达产物的分子质量为133.3176 ku。以上研究结果为进一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下了良好的基础。

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