自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌CK-MB、cTnI及细胞线粒体的影响

沈定荣 王 涛 张 青 马 超 孟保英

中国医科大学深圳儿童医院心血管中心（518026）

未成熟心肌的心肌保护是目前研究的热点。目前对未成熟心肌的定义还没有统一明确的标准。一般把未成熟哺乳动物（羚羊6d，猪龄15d，新西兰兔龄4d，犬龄8周）新生儿及婴幼儿心肌称为未成熟心肌[1]。许多医院在心脏手术时都采用与成年患者基本相似的心脏停搏液，可能导致婴幼儿未成熟心肌损伤。

常用的停搏液种类较多，各自特点不同，对未成熟心肌的保护效果差异显著。由于具有良好的心肌保护效果，HTK液被广泛使用。本研究通过观察自体冷血停搏液以及HTK液灌注后的心肌，在主动脉开放30min的ATP含量及线粒体形态的变化，来评价自体冷血停搏液能否减轻缺血再灌注期未成熟心肌的损伤。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2007年6月至2010年3月在中国医科大学深圳儿童医院收治的行体外循环室间隔缺损修补术的患儿40例，其中男25例，女15例；年龄2.5～12个月；体质量3.6～8.4kg。按计算机随机数列分为实验组（n=20）和对照组（n=20）。所有入组患儿均经家长知情同意，医院伦理委员会讨论通过。患儿术前均无肝肾功能异常，无肺炎等合并症，末梢血象在正常范围。主动脉阻断后，实验组用自体冷血停搏液、对照组用HTK液根部灌注。所有手术由同一组医师、麻醉师、体外循环师合作完成。

1.2 方法

1.2.1 心脏停搏液制备

实验组：CPB开始前，经主动脉根部按血液：晶体4∶1比例快速抽取血液，K+浓度20mmol/L，抽血时间约30s，保持动脉收缩压≥30mmHg，停搏液制备完毕后，经主动脉插管补充血容量以维持循环稳定。对照组：采用HTK液。停搏液配制后浸入冰屑液中制成4℃冷停搏液备用。

1.2.2 CPB及心肌保护

采用JOSTRA人工心肺机，POLYSTAN膜式氧合器，全血预充，CPB采用浅、中低温（25～32℃），红细胞比容（HCT）0.25～0.30。并行循环降温，阻断升主动脉，灌注心脏停搏液。

1.2.3 灌注方法

按实验设计分别灌注停搏液。实验组：升主动脉阻断后，主动脉根部灌注4℃自体冷血停搏液。首次剂量30ml/kg，灌注压力40mmHg，每间隔30min重复1次，第2次灌注K+浓度10mmol/L。对照组：经主动脉根部灌注HTK液（4℃），30mL/kg次，灌注压力20～30mmHg。

1.2.4 心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）分别于术前、术毕、术后24、48h经桡动脉抽血3mL送检。为消除CPB血液稀释对测定值的影响，所有样本同时测定HCT，按照Taylor公式对所有数据进行校正。稀释后物质含量校正值=实测值×（转流前HCT/取样时HCT）。cTnI及CK-MB应用BECKMAN-LX20（美国）全自动生化分析仪检测。试剂购于BECKMAN公司。

1.2.5 心肌电子显微镜检查

分别在体外循环前及主动脉开放30min取右心耳1mm×1mm×1mm，2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，乙醇-丙酮逐级脱水，树脂Epon812包埋，半薄切片经甲苯胺蓝染色后光镜下定位，超薄切片经醋酸双氧铀-枸橼酸铅染色，在JEM-1230透射电镜观察。 参照Flameng等[2]评分法计量。每标本随机选5视野，每视野随机选20个线粒体。计算100个线粒体的平均分。按下述标准分级：0级（0分）结构正常。Ⅰ级（1分）结构基本正常，基质颗粒丢失。Ⅱ级（2分）线粒体肿胀，基质透明。Ⅲ级（3分）嵴断裂，基质凝固。Ⅳ级（4分）线粒体内外膜完整性消失，呈空泡状。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 临床资料

两组患儿的年龄、体质量、CPB时间、主动脉阻断时间比较无统计学差异（P＞0.05），见表1。

2.2 同组手术前后比较

cTnI术毕达高峰（P＜0.01），术后24、48h逐渐下降，但仍维持较高的水平（P＜0.01），CK-MB术后24h达到高峰（P＜0.05、P＜0.01），术后48h逐渐下降（P＜0.05）。实验组与对照组各相同时点比较：cTnI和CK-MB术前无显著性差异（P＞0.05），术毕cTnI有显著性差异（P＜0.01），见表2、表3。

图1 实验组阻断前线粒体基本完好（×12000）

图2 对照组阻断前线粒体基本正常（×6000）

图3 实验组开放后30min线粒体基本完好（×10000）

图4 对照组开放后30min线粒体普遍肿胀，偶见嵴断裂（×12000）

图5 实验组开放后30min线粒体损伤最严重图片，大部分完好，偶见轻度肿胀（×12000）

图6 对照组开放后30min线粒体损伤最严重图片，可见肿胀、嵴断裂（×8000）

表1 两组患儿临床情况（±s）

表1 两组患儿临床情况（±s）

例数 实验组 对照组20（男13女7） 20（男12女8）年龄（年） 5.70±2.23 5.98±1.96体质量（kg） 6.05±1.16 6.34±1.17主动脉阻断时间（min） 38.96±8.70 39.44±8.71 CPB时间（min） 61.01±11.37 60.87±9.72

表2 各时点cTnI的变化

表3 各时点CK-MB的变化

表4 心肌线粒体Flameng评分（±s）

表4 心肌线粒体Flameng评分（±s）

同组与术前比较*P＜0.05，**P＜0.01；相同时点与实验组比较#P＜0.05，##P＜0.01

实验组(n=20) 对照组(n=20)主动脉阻断前 0.582±0.50 0.601±0.43主动脉开放后30min 1.725±0.52** 2.056±0.47**#

2.3 主动脉阻断前、开放后30min心肌线粒体形态对比

两组患儿在主动脉阻断前、开放后30min心肌线粒体形态对比结果。由摄片可见主动脉阻断前心肌线粒体基本完好，偶见基质颗粒丢失或线粒体肿胀。主动脉开放后，线粒体出现不同程度损伤样改变，如颗粒丢失或嵴断裂（图1～图6）。

2.4 主动脉阻断前、开放后30min心肌线粒体Flameng评分

两组患儿心肌线粒体Flameng评分在主动脉阻断前无统计学差异（P＞0.05），主动脉开放后30min则显著增高（P＜0.01），而开放后30min对照组评分比实验组明显增高（P＜0.05），见表4。

3 讨 论

本实验中，同组手术前后比较，cTnI术毕达高峰（P＜0.01），术后24、48h逐渐下降，但仍维持较高的水平（P＜0.01），CK-MB术后24h达到高峰（P＜0.05、P＜0.01），术后48h逐渐下降（P＜0.05）。心肌线粒体Flameng评分在主动脉开放后30min显著增高（P＜0.01）。这说明主动脉开放后，随着冠状动脉再次通血、心脏复跳，心肌出现了缺血/再灌注损伤。造成上述现象的原因与下列因素有关：自由基生成增多；细胞内钙超载；白细胞趋化、黏附及对组织的损伤；高能磷酸化合物缺乏；内皮素对心肌的损伤；血管紧张素Ⅱ（angiotensionⅡ）对组织的损伤。

实验组与对照组各相同时点比较：cTnI和CK-MB术前无显著性差异（P＞0.05），而术毕上述两指标均有显著性差异（P＜0.01）。开放后30min对照组Flameng评分比实验组明显增高（P＜0.05）。这说明实验组心肌损伤较对照组轻，即自体冷血停搏液心肌保护效果优于HTK液。作为含血停搏液，自体冷血停搏液携氧性好，可减少心脏停搏时冠状动脉缺血缺氧。另外，它含有丰富的蛋白，具有稳定的胶体渗透压，可防止血管内水分外渗。与普通含血停搏液不同的是，由于其血液成分避开了体外循环管路，即避免了因心肺转流、血液与管道接触而引起的补体活化及大量中性粒细胞（PMN）的激活，最终避免了因此而引起白细胞浸润[3]、产生氧自由基或释放蛋白水解酶直接激活补体，从而减轻心肌再灌注损伤。

自体冷血停搏液直接取自主动脉根部的动脉血。在抽取主动脉根部血液过程中，主动脉收缩压由90mmHg逐渐降至30mmHg，持续时间约30s。停搏液配制完毕，由体外循环灌入等量血液，使血压恢复至配停搏液前水平，再开始并行循环。因此，在心脏停搏前，出现短时间的全身器官灌注不足，即缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）。国内外许多学者认为IPC对心肌的保护是迄今发现最强的内源性保护，其确切机制尚不清楚。近来研究表明，短暂缺血/再灌注产生的氧自由基、腺苷、一氧化氮、缓激肽和去甲肾上腺素等物质，与其相应受体结合激活酪氨酸激酶与蛋白激酶C（PKC），引起靶蛋白磷酸化及ATP 敏感钾通道（K-ATP）的开放以达到保护效果[4,5]。延迟性保护机制涉及基因转录、蛋白质的合成等，保护性蛋白，如超氧化物歧化酶（SOD）、热休克蛋白（HSP）的表达可能是参与该保护性机制的重要环节[6]。

由此可见，缺血再灌注损伤在体外循环下心内直视手术中不能完全避免，但使用合适的停搏液以及恰当的灌注方法可以减轻其带来的伤害。自体冷血停搏液与HTK液相比能减少心肌释放cTnI和CK-MB，减轻线粒体损伤，对心肌有良好的保护作用。同时可进一步改善术后心功能及预后，提高手术成功率，降低医疗费用，值得进一步推广。

[1] 万里飞,苏肇伉,祝忠群,等.冷痉挛对未成熟心肌功能、能量代谢与超微结构的影响[J].临床心血管病杂志,1999,15(2): 77-80.

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[3] 王云,易定华,韩恩善,等.抑制心内直视术中核转录因子激活保护心肌研究[J].中华试验外科杂志,2006,23(7): 885.

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