单双波长在生物活性测定中的比较研究

赵 鸿

（北京双鹭药业股份有限公司，北京 100041）

生物制品活性测定实验大多用MTT法，使用酶标仪扫描比色，通过数据分析得出实验结果。一般酶标仪有单波长和双波长两种测定模式[1-2]，而且采用的都是垂直光路。选择单波长测定就是选择测定波长[3]，直接测定样本的吸光度。而双波长测定时采用不同的波长，即测定波长（主波长）和参比波长（次波长）同时测定样品的吸光度，以清除一些外在影响因素，提高测定结果的精密度和准确度。但鉴于日常工作关于单双波长对于实验结果的影响程度不是很了解，因此想通过此次比较实验了解单双波长对生物活性测定实验结果影响的大小以及单双波长哪个更适合于生物活性测定实验。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Emax酶标仪（美国分子仪器公司）；单道移液器[1ml（Gilson）、200 μl（Gilson）、20 μl（Gilson）]；8 道移液器（Finnpipette）。

1.2 试药

本公司生产的 IL-11 成品（批号：20080801，600 U IU/支）；IL-11 原液（批号：20080804，4.563 mg/ml）。

2 方法与结果

2.1 MTT比色法

B9-11细胞常规培养，实验时离心收集对数生长期的细胞，以10%新生牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞数为2×105个/ml，每孔加入 50 μl细胞悬液，再加入 50 μl待测的样品（空白对照孔加 50 μl培养基），在 37℃、5%CO2条件下培养 72 h后，每孔加入 5 mg/ml的 MTT溶液 10 μl，继续培养4 h，而后加入MDF裂解液100 μl，37℃孵育过夜，酶标仪扫描570 nm或570 nm+630 nm测定OD值，使用软件SOFTmaxPRO 3.1分析得出实验结果。

2.2 单双波长测定结果比较

本公司生产的 IL-11成品（批号：20080801，600 U IU/支）和 IL-11 原液（批号：20080804，4.563 mg/ml）的单波长 570 nm和双波长570 nm+630 nm测定结果的比较[1]，见表1、2。

由表1、2可知，成品和原液相应的单波长和双波长测定结果相接近，单波长测定结果的标准方差和CV（%）明显高于双波长。

表1 IL-11成品两种测定方法的测定结果Tab.1 Resluts of two detecting methods of finished product IL-11

表2 IL-11原液两种测定方法的测定结果Tab.2 Resluts of two detecting methods of original liquid IL-11

2.3 IL-11成品单双波长各扫描两次测定结果的稳定性比较[4] 见表3。

表3 IL-11成品单双波长两次测定结果Tab.3 Resluts of Dual-wavelength method of finished product IL-11

由表3可知，单波长两次测定结果比双波长两次测定结果差异大，双波长测定两次的结果重复性好于单波长。

2.4 IL-11成品单双波长测定结果相对偏差的比较 见表4。

表4 IL-11成品两种测定方法的测定结果相对偏差Tab.4 RSD of two kinds of detecting methods of finished product IL-11

由表4可知，单波长测定方法的相对偏差明显高于双波长测定。

2.5 IL-11样品生物活性测定细胞空白吸光度的比较 见表5。

表5 IL-11样品生物活性测定细胞空白对照孔吸光度OD值Tab.5 Blank absorbance on bioactivity detection of sample IL-11

由表5可知，双波长可以排除一部分划痕和洗涤剂对实验的可能干扰，其吸光度OD值明显小于单波长。

为了降低检验成本，生物活性测定实验所使用96孔细胞培养板均非一次性使用，不可避免的存在划痕和洗涤剂等残留物。

3 讨论

单波长测定时通过对显色具有最大吸收的波长如570 nm进行吸光度测定[1]，而双波长测定则是酶标仪在敏感波长如570 nm和非敏感波长630 nm下各测定1次，敏感波长下的吸光度为特异性显色的吸光度与板底被赃物（包括划痕）污染后的吸光度之和，非敏感波长下测定的是改变波长到一定值，使特异显色的吸光值为零，此时测得的吸光度即为赃物的吸光度，最后酶标仪给出的数值为敏感波长吸光度值与非敏感波长的吸光度值的差。

酶标仪采用垂直光路，特点是样品吸光度受液体浓缩或稀释的影响小，但受被测样品液面是否水平、细胞板的透光性、孔底是否平整等因素的影响较大。 因此孔与孔之间存在一定的差异。

酶标仪在用单波长测定时，除受到测定的干扰和电路干扰等因素外，受液体表面张力的影响也很大。由于表面张力的作用，液体的表面不是一个平面，而是形成一个凹液面，光线通过液体时，除被液体吸收一部分，还有一部分被折射和反射，影响吸光度的检测，且使用的洗涤剂均含有表面活性剂，这样液面会更凹，对单波长的影响更大。双波长的测定时采用两个不同波长（测定波长和参比波长）同时测定一个样品的吸光度，它们的差值是样品相对准确的吸光度，这样就会减少了测定干扰和电路干扰。

双波长差吸光度法具有可以克服一些外界环境的影响[5-6]，共存组分吸收谱叠加的干扰，以及减少比色的光学不均一性等特点，吸光度在一定的范围内有良好的线性关系。

因此，双波长测定明显比单波长更适合于生物活性测定实验，其可以提高实验结果分析的准确度，减少实验误差。

[1]邱娜.酶标仪单、双波长检测的比较[J].临床输血与检验,2007,9(1):61.

[2]李正勇.酶标仪单波长和双波长检测技术分析[J].现代医药卫生,2005,21(1):24.

[3]梁双吟,李小云,庄祥龙.酶标仪单波长和双波长的比较[J].海南医学,2006,17(3):113.

[4]阮艳秋,陈志远.酶标仪双波长和单波长检测技术分析[J].西部医学,2008,20(1):180-183.

[5]林开生,邓勉君.酶标仪双波长和单波长选择的测试对比[J].国际医药卫生导报,2004,10(12):150.

[6]李雪志.双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展前景[J].实用医学检验杂志,1996,3(1):58.