高效液相色谱法测定清凉散颗粒中连翘苷的含量

刘中丽 郑仲毅

国药控股深圳中药有限公司(518029)

清凉散颗粒主要由连翘、金银花、石膏、柴胡等药物组成[1]，具有清热解毒，凉血散结之功效，主要用于毒热炽盛，具有高热，口渴尿赤，便结，苔黄舌质红，脉弦数等实热症候有抗药性或过敏反应的患者。现采用HPLC法测定该品种作为君药——连翘的主要有效成分连翘苷的含量。

1 实验材料

1.1 实验材料

清凉散颗粒由国药控股深圳中药有限公司提供(批号:0901141、0901121、0901131、0810131、0812041、0812021、0812031、0810111、0809031、0809021)；缺连翘阴性对照由国药控股深圳中药有限公司提供；连翘苷对照品(中国药品生物制品检定所110821-200711)；乙腈为色谱纯试剂；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

高效液相色谱仪:Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪；电子分析天平:瑞士Mettler AE-240及AE-200；KQ-250超声波清洗器(功率250W，40kHz):昆山市超声仪器有限公司；UV-2501PC紫外可见分光光度计:日本岛津；YB-Z真空恒温干燥箱:天津药典标准仪器厂。

1.3 色谱条件及系统适应性

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(22∶78)为流动相；检测波长为228nm；流速为1.0mL/min。在此条件下连翘苷与其他组分达到基线分离，分离度＞1.5，理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000[1]。

2 方法学考察

2.1 对照品溶液制备

精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含连翘苷44μg的溶液，即得。

2.2 阴性对照溶液制备

取相当于供试品的量，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品装量差异项下颗粒约5g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再精密称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 实验条件的确定

2.4.1 测定波长的选择

取连翘苷对照品甲醇溶液，在200～400nm波长范围内扫描，结果在200、228、277nm波长处均有吸收峰，由于200nm已靠近紫外吸收区的末端，不宜采用，比较了同一份对照品溶液注入液相色谱仪在228nm与277nm波长分别测定，结果在228nm波长处仪器的响应值是277nm的3倍。因此采用了228nm作为检测波长。紫外光谱扫描结果见图1。

2.4.2 专属性

精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪中，结果在连翘苷对照品色谱保留时间相应位置上无干扰，见图2。

2.5 线性

精密称取连翘苷对照品0.01487mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(0.5948mg/mL)。精密吸取上述贮备液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度。注入液相色谱仪，平行进样各两次，以两次峰面积平均值为纵坐标、连翘苷浓度(μg/mL)为横坐标，在5.948～118.96μg/mL的范围内，得回归方程为:Y=18.705X-0.5866，r=0.9999，见表1和图3。

2.6 范围

每袋含连翘以连翘苷(C29H36O15)计，不得少于1.5mg。范围的考察可按表2来设计试验。

2.6.1 范围-准确度用的对照品贮备液制备

精密称取连翘苷对照品0.01555g，置20mL量瓶，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液B；精密吸取贮备液B 5mL，置20mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液C。

2.6.2 范围-准确度用的供试品溶液制备

精密称取清凉散颗粒粉末(批号0901141，平均装量9.7708g，含连翘苷2.16mg/袋)共12份，分别置具塞的锥形瓶中，精密加入上述范围-准确度用的对照品贮备液适量(表3)，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

表1 线性回归试验结果

图1 连翘苷对照品紫外光谱扫描图

图2 清凉散颗粒HPLC图

图3 连翘苷线性关系图

图4 不同色谱柱供试品色谱图

2.7 精密度

表2 范围试验设计

表3 范围-准确度试验测定结果

表4 重复性试验结果

2.7.1 重复性试验

取同一批号的清凉散颗粒(批号0901141，平均装量9.7708g)约5g，共6份，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，测定，即得。结果重复性良好，见表4。

2.7.2 中间精密度试验

取同一批号的清凉散颗粒(批号0901141)，分别由实验员甲、乙、丙按同一方法在不同时间，用同一台仪器测定，结果见表5。

2.8 准确度

2.8.1 加样回收用对照品贮备液制备

精密称取连翘苷对照品0.01027g，置20mL量瓶，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液A；另精密称取连翘苷对照品0.01555g，置20mL量瓶，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液B；精密吸取贮备液B 5mL，置20mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液C。

表5 重现性试验结果(n=2)

2.8.2 加样回收供试品溶液的制备

精密称取清凉散颗粒粉末(国药控股深圳中药有限公司，批号0901141，平均装量9.7708g，含连翘苷0.2208mg/g)共15份，分别置具塞的锥形瓶中，精密加入上述加样回收用对照品贮备液适量(表6)，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表6。

表6 准确度测定试验结果

2.9 耐用性

2.9.1 不同色谱柱的考察

取同一供试品溶液，按拟定含量测定方法操作，考察在使用不同乙醇提取含量最低，其他提取方法结果基本一致，考虑方法一步骤简便，故采用方法1。

表7 不同色谱柱的试验结果

表8 不同柱温的考察结果

表9 稳定性试验结果

表10 样品含量测定结果

表11 不同提取方法试验结果(n=2)

表12 提取溶剂量试验结果

根据试验结果，提取溶剂选择25mL。

表13 不同提取时间试验结果

试验结果表明不同超声处理时间测得结果，30和40min大致相同，故选择采用处理时间为30min。色谱柱的情况下，连翘苷含量测定结果不受影响的程度，结果见图4及表7。

2.9.2 不同柱温的考察

取同一供试品溶液，按拟定含量测定方法操作，考察本品在不同柱温的情况下，连翘苷含量测定结果不受影响的程度，结果见表8。

2.9.3 被测溶液的稳定性

取同一份供试品溶液，间隔一定时间分别进样，记录峰面积，测定结果见表9，表明被测溶液在7h内稳定。

2.10 含量测定

取不同生产批号的清凉散颗粒，按含量测定方法操作，测定，结果详见表10。

3 讨 论

3.1 提取方法的考察

方法1:取本品粉末5g，精密称定，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，取续滤液，即得。方法2:取本品粉末5g，精密称定，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，取续滤液10mL，加在中性氧化铝柱(100～200目，4g，内径1cm)上，用稀乙醇70mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。方法3:取本品粉末5g，精密称定，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，取续滤液10mL，蒸干，残渣加稀乙醇10mL使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，4g，内径1cm)上，用稀乙醇70mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。方法4:取本品粉末5g，精密称定，加乙醇20mL，超声处理30min，以下同方法3。方法5:取本品粉末5g，精密称定，加甲醇20mL，加热回流30min，滤过，取续滤液10mL，蒸干，残渣加稀乙醇10mL使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，4g，内径1cm)上，用稀乙醇70mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。

按上述色谱条件进行测定，结果见表11。

3.2 提取溶剂量的考察

取本品粉末5g，精密称定，分别加甲醇20、25、50mL，超声处理30min，滤过，取续滤液，按上述色谱条件进行测定，结果见表12。

3.3 超声处理时间的选择

取本品粉末5g，精密称定，分别加甲醇25mL，考察超声处理10、20、30、40min，结果见表13。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2005年版.北京:化学工业出版社,2005:117.