护胃方对吲哚美辛致急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡的影响

张露蓉 江国荣 周水英 任光荣 南京中医药大学附属苏州市中医医院(苏州 215003)

非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatory drugs,NSAIDs)所致急性胃黏膜病变(acute gastric mucosal lesion,AGM L)是一种以胃黏膜糜烂、溃疡、出血为主要病理特征的急性应激性病变,是临床上常见的急性胃黏膜病变之一。有报道AGM L约占上消化道出血病因的 31.61%,仅次于消化性溃疡出血[1]。本文拟观察临床治疗验方护胃方对 AGM L模型大鼠的胃粘膜组织病理变化、细胞凋亡与增殖指标的影响,初步探讨护胃方预防 AGM L的作用及其可能的机制。

1 实验材料 1.1 药物 护胃方水煎液:由生大黄、三七、龙胆草、吴茱萸等组成,饮片由苏州春晖堂中药饮片厂提供,实验室自行提取;吲哚美辛肠溶片:江苏亚邦爱普森药业有限公司,国药准字 H32021431;水合氯醛:苏州大学附儿院制剂室,批号:200707;ED-T A-Na2◦ X(H2O):上海山浦化工有限公司,批号:39161;T UN EL、蛋白酶 K、SP超敏浓缩试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司;Bcl-2、Bax、PCNC抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器 SN-697全自动放免计数器,上海原子核研究所日环光电仪器有限公司;冷冻高速离心机,美国 Beckman公司;琅珈病理图像分析系统。

1.3 动物 清洁级健康雄性 SD大鼠 50只,体重 250～300g,由浙江省实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(浙 )2003-0001。

2 实验方法 2.1 动物的分组将 50只大鼠适应性饲养1周,按体重随机分为 5组:正常对照组、AGM L模型组、护胃方 3个剂量组,每组 10只。

2.2 消炎痛胃黏膜损伤模型的制备参照文献[2-3],实验动物以 40mg◦ kg-1吲哚美辛混悬液灌胃大鼠,3h后胃黏膜损伤模型制备成功。

2.3 给药方法[4]正常对照组和模型组每天以蒸馏水灌胃,护胃方低、中、高 3个剂量组分别给予 1.125g生药◦ kg-1、2.250g生药◦ kg-1、4.500g生药◦ kg-1的护胃方水煎液灌胃。灌胃量均按 10mL◦ kg-1折算,每天 1次,连续 5d。各组别在第5d给药前禁食不禁水 12h,第 5天末次给药 1h后:正常对照组给予以 0.5%羟甲基纤维素钠蒸馏水灌胃,其它组以 40mg◦kg-1吲哚美辛混悬液 (溶剂为 0.5%羟甲基纤维素钠)灌胃造模。

2.4 标本采集及处理 各组大鼠灌胃消炎痛造模 3h后,以水合氯醛(300mg◦ kg-1)腹腔注射麻醉,开腹取胃,沿胃大弯剪开,取病变区胃窦胃粘膜组织-80℃保存;余胃固定于10%的中性缓冲甲醛溶液中。取胃腺区组织块 0.5cm×0.5cm,固定、包埋,酒精梯度脱水,制作石蜡病理组织切片,片厚 8 μm。另取腺胃区组织块 0.5cm×0.5cm,固定、脱水后在恒温箱切片机内作冰冻切片,片厚 10 μm。

2.5 各项指标的检测方法 2.5.1胃黏膜肉眼观察:肉眼观察胃粘膜表面情况,显微镜下拍照,观察有无充血,水肿,糜烂,出血等情况。

2.5.2 胃黏膜病理观察:采用常规的 HE染色法 ,光镜下观察胃粘膜形态结构,并且进行胃粘膜炎症评定,对每一张病理切片做诊断评估。胃粘膜炎症分级积分参照 Rauws分级标准[5]:粘膜固有层炎症细胞、单核细胞、浸润的密度 0～2分;粘膜固有层嗜中性多核粒细胞浸润的密度 0～3分;粘膜上皮内嗜中性多核粒细胞的密度 0～3分;浅表糜烂的程度 0～2分。每个参数的打分标准为:0是没有,1是轻度,2是中度,3是重度。应用总分 0～10的变化来衡量胃黏膜炎症的程度。

2.5.3 采用 TUN EL(原位末端标记法)检测凋亡指数(AI):按照试剂盒说明操作,以 PBS代替 TdT为阴性对照。凋亡结果判定:细胞核内呈现棕黄色颗粒者均为凋亡细胞。由专人肉眼随机观察 5个高倍视野,分别记录凋亡细胞数和总细胞数,计算凋亡指数(apoptosis index.AI)=凋亡细胞数 /总细胞数×100%。

2.5.4 免疫组化法 (SP法)检测细胞凋亡基因 bcl-2和Bax的表达与增殖细胞核抗原(PCN A)的表达按试剂盒说明操作。光镜下以细胞染色呈棕黄色为阳性细胞,随机观察 5个高倍视野,分别记录阳性细胞数和总细胞数,胃黏膜染色阳性率=阳性细胞数 /总细胞数×100%。

3 实验结果 3.1 胃黏膜肉眼观察结果 正常大鼠胃黏膜色泽红润,未见损伤性改变。模型大鼠胃腔内见血性积液,粘膜表面附有大量血痂,用无菌纱布擦拭后,见粘膜充血水肿明显,腺胃部弥漫点线状出血灶。护胃方高、中剂量组大鼠粘膜可见少量糜烂、出血点,其损伤程度均轻于模型组,护胃方低剂量组与模型组差异不明显。

3.2 胃黏膜病理学观察结果光镜下见正常大鼠胃黏膜形态结构完整,未见损失性改变;模型组大鼠胃粘膜上皮细胞受损、脱落,部分粘膜中断 ,腺体结构紊乱,期间有大量红细胞聚集,粘膜层及粘膜下层明显充血水肿,形成多个大小深浅不等的糜烂面,并有较多炎性细胞浸润;护胃方高、中剂量组胃黏膜糜烂程度减轻,上皮结构逐渐恢复,与模型组比较粘膜充血水肿减轻,护胃方低剂量组与模型组差异不明显。

3.3 护胃方对胃黏膜炎症评分的影响模型组大鼠胃黏膜炎症积分较正常对照组明显升高(P＜0.01),说明一定剂量的吲哚美辛灌胃可以造成大鼠 AGM L,提示本实验 AGM L模型复制成功。护胃方高、中剂量组的胃黏膜炎症积分均较模型组下降(P＜0.01);护胃方低剂量组的炎症积分较模型组降低不明显(P＞0.05)。各组大鼠胃黏膜炎症评分统计情况见表 1。

表1 胃黏膜炎症评分统计表(,n=10)

表1 胃黏膜炎症评分统计表(,n=10)

与正常对照组比较:△P＜0.01;与模型组比较▲P＜0.01。

3.4 护胃方对胃黏膜凋亡指数的影响正常对照组大鼠胃黏膜上皮散在有 TUNEL标记阳性细胞,胞核呈棕黄染色,主要位于胃腺底、体部,呈弱阳性表达。模型组可见大量 TUNEL标记阳性的胃黏膜细胞,阳性细胞分布由胃腺底部至粘膜表面呈递减趋势,成强阳性表达 (胃黏膜凋亡增强),这与文献[3]报道一致。各用药组亦可见 TUNEL标记阳性的阳性细胞,较模型组有不同程度的减弱趋势。胃黏膜细胞凋亡指数统计分析(见表 2),模型组凋亡指数较正常对照组显著增多(P＜0.01);护胃方各剂量组凋亡指数较模型组均呈现不同程度的减少(P＜0.01)。

表2 大鼠胃黏膜细胞凋亡指数统计表(,n=10)

表2 大鼠胃黏膜细胞凋亡指数统计表(,n=10)

与正常对照组比较:△P＜0.01;与模型组比较▲P＜0.01。

3.5 护胃方对凋亡调控基因 Bcl-2和 Bax蛋白表达的影响正常对照组胃黏膜组织中 Bcl-2蛋白的表达主要在胃腺区,呈散在分布,细胞着色较浅,呈中等阳性表达,胞浆呈棕黄染色;在模型组中 Bcl-2蛋白的表达减弱,呈弱阳性,较正常对照组显著减少(P＜0.01);而在护胃方高、中剂量组中,Bcl-2蛋白的表达呈增强趋势,较模型组明显增多(P＜0.01),以护胃方高剂量组更为明显。正常胃黏膜组织中 Bax蛋白主要在上皮细胞层,散在分布 ,呈中等阳性表达,细胞浆呈棕黄染色;在模型中 Bax蛋白的表达增强,呈强阳性,较正常对照组明显增多(P＜0.01);在护胃方高、中剂量组中 Bax蛋白的表达呈下降趋势,较模型组表达减少(P＜0.01),同样以护胃方高剂量更为明显。见表3。

表3 大鼠胃黏膜中 Bcl-2和 Bax表达的阳性细胞率统计表(,n=10)

表3 大鼠胃黏膜中 Bcl-2和 Bax表达的阳性细胞率统计表(,n=10)

与正常对照组比较:△P＜0.01;与模型组比较 ▲P＜0.01。

组别 给药剂量 Bcl-2(%) Bax(%)正常对照组 - 19.47±0.59 16.35± 0.59模型组 - 14.11± 0.26△ 50.23± 0.79△护胃方组 1.125g生药◦ kg-1 14.03±0.37 46.44±0.612.250 g 生药◦ kg-1 15.03± 0.31△ 40.83± 0.59▲4.500 g生药◦ kg-1 16.40± 0.47△ 34.55± 0.86▲

3.6 护胃方对细胞核增殖抗原 PCNA表达的影响 正常对照组胃粘膜细胞,PCN A主要在胃腺颈部靠近胃上皮部表达,呈中等阳性表达,胞核呈棕黄染色;模型组 PCNA表达减弱,呈弱阳性表达 ,较正常对照组减少(P＜0.01);护胃方高、中剂量组表达较模型组增强,呈中等阳性表达(P＜0.01)。见表 4。

表4 大鼠胃黏膜中 PCNA表达的阳性细胞率统计表(,n=10)

表4 大鼠胃黏膜中 PCNA表达的阳性细胞率统计表(,n=10)

与正常对照组比较:△P＜0.01;与模型组比较▲P＜0.01。

组别 给药剂量 PCNA(%)正常对照组 - 28.65± 0.53模型组 - 17.07± 0.39△护胃方组 1.125g生药◦ kg-1 17.94± 0.412.250g生药◦ kg-1 20.36± 0.34▲4.500 g生药◦ kg-1 22.74± 0.32▲

4 讨 论 AGML的发生、发展是一个复杂的、多因素综合的过程,大量的基础和临床研究表明,其发病机制除 H+的逆扩散、胃黏膜微循环障碍、氧自由基的损伤作用,神经内分泌失调及前列腺素等物质的保护作用减弱外,胃黏膜完整性的维持需依赖上皮细胞增殖和凋亡之间的相对平衡,因此胃黏膜细胞凋亡与增殖的变化,也是 AGM L发生的重要机制之一。业已证实,正常胃黏膜细胞存在凋亡,是一种顺序性的细胞主动死亡过程,它与细胞增殖一起共同调节胃黏膜结构和功能的稳态。有研究报道:在 AGML应激期,不但伴随着胃黏膜细胞凋亡的明显增加,而且伴随着增殖能力的下降,他们之间的失衡是溃疡发生的重要原因[6]。细胞凋亡和增殖严格受基因调控,目前研究较多的有 Bcl-2/Bax细胞凋亡基因家族和增殖细胞核抗原(PCN A),后者与细胞 DNA合成关系密切 ,在细胞增殖的启动上起重要作用,可标记 S期、G期及 M期的增殖细胞,是反映胃黏膜增殖功能的可靠指标。目前西医预防 AGML的药物治疗,多偏重于降低攻击因子方面,如 H2受体拮抗剂,质子泵抑制剂等。因此,寻找多途径、多靶点的作用药物,包括对胃粘膜细胞凋亡与增殖平衡作用的药物研究,可为防治 AGM L研究拓展思路。

AGM L属中医“胃脘痛”、“吐血”、“便血”等范畴 ,中医辨证多以胃热壅盛和瘀血阻络为主,故论治时应以清热化瘀为主,辅以理气和胃。大量临床资料和实验研究[7-8]也证明:中药治疗具有保护胃粘膜,促进其修复和愈合的作用。护胃方由生大黄、三七、龙胆草、吴茱萸等药物组成,长期临床应用观察显示,该方可有效减轻患者的症状,提高临床痊愈率。本实验结果显示,预防性使用该方可明显减轻吲哚美辛致 AGML模型大鼠的胃粘膜损伤程度、降低炎症积分,使胃粘膜组织中的 Bcl-2蛋白表达增强和 Bax蛋白表达下降及减少胃粘膜细胞凋亡,同时使 PCN A的表达增强。说明护胃方具有预防 NSAIDs致AGM L作用,其可能机制为抑制细胞凋亡和促进细胞增殖;中药复方同时具有多途径、多靶点效应,在有效预防 AM GL方面较单纯抑制胃酸药存在综合作用的更多优势,值得进一步深入研究。

[1]Saowar V,Udayachalerm W,Wee-Saku.et al.J med Assoc Thai,1994,77(11):561-565.

[2]Jimanez D,Martin M J,Pozo D,et al.M echanisms involved in protection afford byLargininen in ibuprofeninduced gastric damage:role of nitric oxide and prostaglandins[J].Dig Dis Sci,2002,47:44-53.

[3]Igarashi M,Takagi A,Jiang X,et al.Analysis of Helicobacter Pylori and non-steroidalanti-inflammatory druginduced gastric epithelial injury.Aliment Pharmacol ther[J].2002,16(suppl 2):235-239.

[4]Xu CD,Gan RB,Chen SN,et al.Protection of gastric mucoma from ethanol induced injury by recombinant epidermal growth factor in rats[J].Word J Gastro-enterol,1998,4:437-438.

[5]Peskar BM,Ehrlich K,Peskar BA.Interaction of cyclooxygenase-2 inhibitors and salicylate in gastric muosal damage[J].Eur J Phamacol,2003,434:65-70.

[6]Peskar BM,Ehrlich K,Peskar BA.Role of ATP-sensitive potassium channels in prostaglandin-mediated gastroprotection in the rat[J].J Pharmacol Exp Ther,2002,301:369-374.

[7]韦 维,林寿宁,黄贵华等.安胃汤对胃溃疡大鼠胃黏膜 EGFR及 TGF-β1表达的影响 [J].陕西中医,2006,27(1):108-110.

[8]周培华 ,孙学军.早期胃癌的诊断进展[J].陕西医学杂志,2007,(2):216-219.