双向发酵对川乌指纹图谱及乌头碱类成分含量的影响Δ

王身艳，潘扬，蒋亚平，唐海霞，陈建伟（南京中医药大学，南京市 210029）

双向发酵对川乌指纹图谱及乌头碱类成分含量的影响Δ

王身艳＊，潘扬，蒋亚平，唐海霞，陈建伟#（南京中医药大学，南京市 210029）

目的：观察川乌被19种药用真菌发酵后，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的变化及高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的差异。方法：将川乌作为“药性基质”，在一定的条件控制下，应用双向发酵技术，使其被槐耳、灵芝、红栓等19种药用真菌发酵，产生药材的“药性菌质”，并采用反相高效液相色谱法对“药性菌质”和生药材中所含的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱进行含量测定，比较其含量的变化及指纹图谱的差异。结果：在一定的时间范围内，大多数的菌株在川乌基质上的适应性良好，菌丝体生长旺盛，如代号A、C、D、E、F、M、Q、V、SW、い等真菌。发酵之后的川乌中乌头碱、新乌头碱及次乌头碱含量与生药材比较多数有明显的降低。结论：双向发酵后多数“药性菌质”中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱含量明显降低了，提示双向发酵是生物技术在中医药领域中应用的有益尝试。

川乌；乌头碱；新乌头碱；次乌头碱；生物转化；反相高效液相色谱法

Δ南京中医药大学科技项目（09XZR18）

＊讲师，博士研究生。研究方向：有毒中药的生物转化。E-mail：wsy741120@yahoo.com.cn

#通讯作者：教授。研究方向：中药资源学。电话：025-85811659

双向固体发酵是南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究中心庄毅教授于20世纪80年代创立的一种新型中药发酵技术，它用具有活性成分的中药作为药性基质，被药用真菌发酵，产生一系列复杂的生理活动和生化效应，从而产生新的活性成分和新的功能，无需将药用真菌与次级代谢产物分离，二者共同使用，协同发挥药效[1]。中药发酵的目的主要是为了增强药效、发现新的治疗作用、减毒解毒、扩大用药品种等。如潘扬等[2]采用药用真菌对马钱子进行双向发酵，结果表明，与空白对照比较，士的宁、马钱子碱的含量均呈下降趋势，而士的宁氮氧化物、马钱子碱氮氧化物有不同程度的增加。

川乌为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的干燥母根，在临床已有几千年的应用历史，具祛风除湿、温中止痛之功效。乌头类药材中含乌头碱、新乌头碱和次乌头碱等双酯型生物碱。这些双酯型生物碱既是毒性成分，也是活性成分，但性质不稳定，遇水加热容易水解成毒性较小的苯甲酰单酯型生物碱及亲水性氨基醇类乌头原碱。目前，乌头的炮制方法过分强调解毒，而忽视乌头的功效特点。本试验通过双向固体发酵技术对乌头类中药进行生物转化研究，以期达到去毒存（增）效的目的。此项研究内容国内、外尚未见报道。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-10AT型高效液相色谱（HPLC）系统，包括LC-10ATAB双泵、SPD-10A紫外检测器、ERC-3415自动脱气机、AT-5300OVEN柱温箱（日本岛津公司）；AE240型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SYZ-550型石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏金坛国胜仪器厂）；国华数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；抽滤泵（瑞士Buchi公司）。

1.2 试剂

乙腈为色谱纯（美国Tedia公司），水为双蒸水，其它试剂均为分析纯（南京化学试剂有限公司）。

1.3 对照品

乌头碱（批号：110720-200410）、新乌头碱（批号：0799-9403）、次乌头碱（批号：0798-9403）对照品均由中国药品生物制品检定所提供。

1.4 样品

运用“双向发酵”技术，通过槐耳、灵芝、红栓等真菌的生物转化过程，发酵后从“药性基质”中获得19个川乌的“药性菌质”样品，另有1个为空白对照（未经发酵）样品。

1.5 真菌菌株的选择

根据以往“双向固体发酵”的经验，首选槐耳、灵芝等19种经过菌株鉴定的药用真菌（南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所保藏）作为在川乌“药性基质”上进行生长条件筛选试验的菌株。

1.6“药性基质”的来源

川乌购自南京市药材公司，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为毛茛科乌头属植物乌头A.carmichaeliDebx.的干燥母根。

1.7 川乌“药性菌质”的培养

在一定的生物技术控制下，使川乌“药性基质”被槐耳、灵芝、红栓等真菌发酵。根据真菌与基质组合的发酵情况，即菌株能否与“药性基质”相适应而正常生长为指标，在菌丝体生长一段时间后，取出各真菌发酵后的“药性菌质”，低温干燥，即得。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱1.4 mg、新乌头碱3.1 mg、次乌头碱3.9 mg，用0.05%的盐酸甲醇溶液定容至5 mL，放置冰箱贮藏，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取川乌样品粉末1.0 g，精密称定，置50 mL具塞烧瓶中，加入适量氨试液润湿，再加入20 mL乙醚，静置24 h，超声提取30 min，滤过，40℃水浴挥干，滴加盐酸-甲醇试液，定容至2 mL，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Hanborn Sci&Tech Bentnach-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-40 mmol·L-1乙酸铵（氨水调pH 9.5），梯度洗脱（0→10 min，A的体积百分数为12%→20%；10→50 min，A为20%→52%；50→80 min，A为52%→60%）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：240 nm；进样量：20 μL。

2.1.4 样品含量的测定及乌头碱类化合物指纹图谱的建立

取不同真菌发酵的川乌“药性菌质”，按上述色谱条件与方法，测定样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的含量变化和川乌指纹图谱的差异。

2.2 结果

2.2.1 菌丝体生长情况及乌头碱类的含量测定结果 在同一发酵条件下，槐耳、灵芝等19种真菌对以川乌生品为“药性基质”的发酵情况有所不同。根据真菌与基质组合双方的发酵情况，初步判定代号为A、B、C、D、E、F、H、L、M、N等19种菌株与药材“药性基质”基本相适应，菌丝体能够正常生长发育。

川乌菌质得率情况：菌丝体生长的好坏与发酵后“药性菌质”相对得率（%）呈负相关，即菌丝体生长较好者，菌质相对得率低；生长较差者，菌质相对得率高。菌质得率（%）＝药性菌质干重（g）/药性基质干重（g）×100%。

川乌菌质得率见表1。

2.2.2 川乌的指纹图谱 利用HPLC的高分离能力，采集双向发酵后川乌药材中复杂的化学成分信息，建立其菌质的生物碱类成分的指纹图谱，详见图1、图2。

从图1、图2可以看出，与发酵空白对照比较，H、V、O①等真菌作用于川乌后，指纹图谱中显示出有不同的新产生的或含量变化较大的未知成分；与市售制川乌比较，指纹图谱中显示出相同的成分，但含量明显高于市售制川乌。

3 讨论

表1 川乌菌质得率Tab 1 The yield of mycoplasma ofA.carmichaeli

图1 川乌的HPLC指效图谱A.混合对照品；B.川乌生药材；C.川乌发酵空白对照；D.市售制川乌；E.川乌+V发酵品；F.川乌+H发酵品；1.新乌头碱；2.乌头碱；3.次乌头碱Fig 1 HPLC chromatograms ofA.carmichaeliA.mixed substance；B.A.carmichaeli；C.fermented A.carmichaeli control；D.A.carmichaeli for sale；E.A.carmichaeli+fermented V；F.A.carmichaeli+fermented H；1.aconitine；2.mesaconine；3.hypaconitine

本试验用川乌药材作为“药性基质”，由选定的药用真菌发酵，产生一系列复杂的生理活动和生化效应，产生新的活性成分和新的功能。一方面药用真菌在生长过程中会产生各种各样的生物活性物质；另一方面进行生命活动所产生的丰富而强大的酶系则是中药发生化学反应的物质基础。现代发酵工程证实，微生物具有水解、酯化、氧化、乙酰化、甲基化、羟基化和羰基化等多种能力，有可能将乌头类中药中的毒性成分双酯型生物碱分解为单酯型或醇胺型或未知类型生物碱，达到降低毒性的目的；也可能将乌头中的成分转化形成新的成分，或者乌头中的成分与药用真菌的次生代谢产物发生复方、协同作用，形成新的化合物。

图2 HPLC图谱比较A.川乌发酵空白对照；B.川乌+O①发酵品Fig 2 Comparison of HPLC chromatogramsA.fermentedA.carmichaeli control；B.A.carmichaeli+femented O①

由上述图谱的对比可以看出，通过真菌的发酵分解，乌头碱类的含量在菌株的转化作用下明显降低，说明乌头碱、新乌头碱、次乌头碱均在真菌的作用下参与了生物转化。而且一些真菌在发酵后，与市售制川乌比较，指纹图谱中显示出相同的成分，但含量明显高于市售制川乌。其药效和毒理实验正在进行中。

药用真菌进行生物转化较其他方法有以下优点：反应选择性强、反应条件温和、能耗少、操作简单、低毒、低残留、不造成环境污染和后处理简单等。其可能完成化学方法难以进行或不能进行的化学反应，得到结构更合理或活性更强的先导化合物。因此，本项研究不仅可为乌头炮制提供新工艺，对其具毒性且有效的成分含量进行测定和研究，为科学地阐明双向固体发酵机制奠定基础，也可保证中药临床使用的安全和有效。

[1]庄 毅.药用真菌新型（双向性）固体发酵工程[J].中国食用菌，2002，21（4）：3.

[2]潘 扬，张 弦，蒋亚平，等.双向发酵前后马钱子生物碱含量及其HPLC指纹谱的比较[J].南京中医药大学学报，2006，22（6）：362.

Effects of Two-way Fermentation on the Fingerprints ofAconitum carmichaeliand the Content of Aconitine

WANG Shen-yan，PAN Yang，JIANG Ya-ping，TANG Hai-xia，CHEN Jian-wei（Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To observe the contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine and the difference of HPLC fingerprints ofAconitum carmichaeliafter fermented with 19 kinds of medicine fungus.METHODS：Under the control of certain experiment conditions，A.carmichaeliwas used as ground substance and fermented by two-way fermentation with 19 kinds of medicine fungus，such asTrametes robiniophila，Ganoderma lucidum，Pycnoporus cinnabarius.The product of medicinal ground substance mixed with mycelia was called“medicinal mycoplasma”.An RP-HPLC method was then established to determine the contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine.The difference of the content and HPLC fingerprints were compared.RESULTS：At different zymolytic times，most of their mycelia grew normally and quickly，especially number A，C，D，E，F，M，Q，V，SW，いand so on.The contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine in fermentedA.carmichaeliwere significantly lower than inA.carmichaeli.CONCLUSION：The contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine in“medicinal mycoplasma”have been decreased significantly.Two-way fermentation is conducive exploration of biotechnology in the filed of traditional Chinese medicine.

Aconitum carmichaeli；Aconitine；Mesaconine；Hypaconitine；Biotransformation；RP-HLPC

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3712-03

2010-01-28

2010-05-05）