微颗粒饲料中添加谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼生长、存活及消化酶活力的影响

高 进,艾庆辉,麦康森

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室;水产学院,山东青岛266003)

微颗粒饲料中添加谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼生长、存活及消化酶活力的影响

高 进,艾庆辉＊＊,麦康森

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室;水产学院,山东青岛266003)

以初始体质量为(2.75±0.31)mg的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)稚鱼(15日龄)为实验对象,在基础饲料中分别添加0.00%(对照组)、0.60%、1.20%和1.80%的谷氨酰胺,并用甘氨酸调节总蛋白质水平一致,制作而成4种粗蛋白58%左右、粗脂肪16%左右的实验微颗粒饲料,在室内养殖系统中投喂大黄鱼稚鱼30 d,研究饲料谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼生长、存活及消化酶活力的影响。实验结果表明,大黄鱼稚鱼的特定生长率和存活率随饲料中谷氨酰胺含量的升高有上升的趋势,但差异未达到显著水平(P>0.05)。饲料中谷氨酰胺的添加未对大黄鱼稚鱼肠段、胰段胰蛋白酶活力和淀粉酶活力,肠段氨基肽酶活力和碱性磷酸酶活力产生显著的影响(P>0.05)。饲料中添加谷氨酰胺未能对大黄鱼稚鱼的生长、存活和消化酶活力产生显著的影响,可能与基础饲料中鱼粉、鱼肉水解蛋白等蛋白源所含有的谷氨酰胺已经达到或超过稚鱼吸收、利用谷氨酰胺的阈值,额外添加的谷氨酰胺不能被吸收利用而未能表现出促进效果。本实验条件下,大黄鱼稚鱼基础饲料中无需额外添加谷氨酰胺即可满足稚鱼正常生长发育的需要。

大黄鱼稚鱼;谷氨酰胺;生长;存活;消化酶活力

谷氨酰胺(Glutamine)是动物血浆中丰富的游离氨基酸,是动物体内蛋白质、核苷酸和氨基糖合成的重要前体,也是快速分裂的细胞包括活化淋巴细胞和肠上皮细胞重要的能量供体[1-3]。在病理状态下,补充谷氨酰胺可以促进病变或损伤组织(如肝脏或者肠道)的修复和加速患者的恢复[4-5]。

研究发现,在日粮中添加谷氨酰胺可以提高人、鼠、猪肠道的重量,促进肠绒毛和肠黏膜的发育,提高肠道蛋白质含量、DNA含量及消化酶活力[6-10]。Lin和Zhou[11]发现饲料中添加谷氨酰胺可以增加建鲤幼鱼体增重、摄食量、肠道重量、肠绒毛高度、碱性磷酸酶活力和钠钾ATP酶活力。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea,Richardson)隶属鲈形目、石首鱼科、黄鱼属,是集群暖温性近海洄游鱼类,是我国重要的经济海水鱼类。自从1980年代,大黄鱼人工育苗成功后,大黄鱼的人工养殖发展迅速,产生了巨大的经济和社会效益。稚鱼对营养物质消化吸收的能力较低且稚鱼饵料中营养成分不完全,从而导致部分稚鱼因营养缺乏而死亡。目前,大黄鱼稚鱼营养生理的研究已有相关报道[12-17]。本实验拟以大黄鱼稚鱼为研究对象,在微颗粒饲料中添加不同含量的谷氨酰胺以探讨其对大黄鱼稚鱼生长、存活及消化酶活力的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验鱼苗及养殖系统

选用初始体质量(2.75±0.31)mg的15日龄大黄鱼稚鱼(购买于福建省宁德市水产技术推广站育苗场)作为实验对象,进行30 d的摄食生长实验。实验共设4个处理,每个处理设3个重复。实验系统由12只蓝色塑料方桶(70 cm×60 cm×50 cm,有效容积200 L)组成,每桶放鱼苗3 000尾。实验用桶均悬挂于一充满水的水泥池中,实验用水为经双层沙滤的新鲜海水,水温21～23℃,盐度25～28,p H=7.8～8.2,溶氧量在6 mg/L以上,光周期为14 L∶10 D,水面光强在1 000 lx以下。换水量随日龄增长递增,每天50%～200%。每天吸底、换水2次。每天投喂8次,养殖过程均采用饱食投喂。

1.2 实验饲料

以低温干燥白鱼粉、低温干燥虾粉、鱿鱼粉、鱼肉水解蛋白和酵母浸出粉为蛋白源;鱼油、精制鱼油及大豆卵磷脂为主要脂肪源;同时添加维生素混合物、矿物质混合物、诱食剂等配制成基础饲料。以甘氨酸为粗蛋白质水平调节组分(甘氨酸不具有谷氨酰胺具有的功能[18]),在基础饲料中添加0.00%,0.60%,1.20%及1.80%的谷氨酰胺。固态饲料原料粉碎后,过140目筛,充分混合,然后添加鱼油等脂肪源充分混合,加水混合后用双螺杆制粒机制粒,50℃烘干,然后破碎、过筛、分级而成粗蛋白58%左右、粗脂肪16%左右、含4个梯度谷氨酰胺的实验微颗粒饲料(见表1)。

表1 实验微颗粒饲料配方及营养组成(%干物质)Table 1 Formulation and proximate chemical composition of the experimental diets

1.3 取样

实验开始时,从育苗池中随机取稚鱼3组,每组300尾,用吸水纸吸干体表水分,然后称质量,取其平均值为初始体质量。实验结束时,饥饿稚鱼24 h,通过点数确定存活尾数,每桶随机取样30尾称质量。其余稚鱼样品液氮封存,然后-70℃保存,以进行消化酶活力分析。

1.4 饲料样品常规分析

饲料样品均在105℃烘干至恒重后依照AOAC[19]方法进行组成分析。采用凯氏定氮法测定样品的总氮含量,将测定结果乘以6.25得粗蛋白含量;采用索氏抽提法,以乙醚为抽提剂测定粗脂肪含量;将样品在电炉上炭化后,在马福炉中灼烧(550℃)8 h后测得样品灰分含量。

1.5 消化酶活力分析

依照Zambonino和Cahu[20]的方法,在冰上解剖大黄鱼稚鱼,将稚鱼消化道分为肠段和胰段,取0.1 g肠段或胰段以0℃蒸馏水匀浆,3 300 g离心3 min,取上清液进行酶活力分析。胰蛋白酶活力的分析按照Holm等[21]的方法,用Nα-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide BAPNA(Sigma B-4875)作底物。淀粉酶活力参照Métais和Bieth[22]的方法测定,用碘溶液显示未水解的淀粉(Sigma S-9765)。肠道总碱性磷酸酶活力的分析参照Bessey等[23]的方法,用p-Nitrophenylphosphate(PNPP,Merck 106850)作底物。肠道总亮氨酸氨肽酶活力的分析参照Maroux[24]方法,用Leucine-p-nitroanilide(Sigma L-9125)作底物。蛋白质浓度依照Bradford[25]的方法测定,酶活力用比活力(mU/mg Pro或U/mg Pro)表示。

1.6 计算公式和统计方法

存活率(Survival,%)=终末尾数/初始尾数×100;

特定生长率(Specific Growth Rate,%/d)=

(Ln终末体质量-Ln初始体质量)/养殖天数× 100;

实验所得数据用平均值±标准差(n=3)表示,实验数据用SPSS 15.0 for windows软件进行单因子方差(ANOVA)分析,当差异显著(P<0.05)时,再进行Tukey多重比较(Tukey HSD test)。

2 实验结果

2.1 谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼生长和存活的影响

饲料中添加不同含量的谷氨酰胺在一定程度上促进了大黄鱼稚鱼的生长,稚鱼的特定生长率在每天10.40%～10.80%之间,但差异未达到显著水平(P> 0.05)。

稚鱼的存活率在26%～29%之间,随饲料谷氨酰胺添加量的增加有上升的趋势,但各处理间差异未达到显著水平(P>0.05)(见表2)。

表2 饲料中添加谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼生长、存活的影响①数据为3个重复的平均值±标准差Values are expressed as means± S.D.(n=3);②BW:body weight;③SGR:specific growth rate.Table 2 Specific growth rate(SGR),survival of large yellow croaker larvae fed the experimental micro-diet for 30 d

2.2 谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼消化酶活力的影响

饲料中添加梯度含量的谷氨酰胺未对大黄鱼稚鱼肠段、胰段胰蛋白酶活力和淀粉酶活力产生显著的影响(P>0.05)(见表3)。胰段胰蛋白酶活力有随着谷氨酰胺添加量上升而升高的趋势(58.84～65.39 mU/ mg Pro),肠段胰蛋白酶活力有随着饲料谷氨酰胺添加量的上升有下降的趋势(39.26～28.40 mU/mg Pro) (见表3)。

表3 饲料中添加谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼肠段及胰段淀粉酶活力和胰蛋白酶活力的影响①数据为3个重复的平均值±标准差Values are expressed as means± S.D.(n=3);②BW:body weight;③SGR:specific growth rate.Table 3 Activities of trypsin and amylase in pancreatic or intestinal segments of large yellow croaker larvae fed the experimental micro-diet for 30 d

饲料中添加谷氨酰胺未对大黄鱼稚鱼肠道氨基肽酶和碱性磷酸酶活力产生显著的差异(P>0.05)(见表4)。碱性磷酸酶活力在123.00～141.00 mU/mg Pro之间,氨基肽酶活力在17.00～23.00 mU/mg Pro之间,碱性磷酸酶和氨基肽酶活力均未表现出规律的变化趋势。

表4 饲料中添加谷氨酰胺对大黄鱼稚鱼肠道碱性磷酸酶及氨基肽酶活力的影响①Table 4 Activities of aminopeptidase N(AN)and alkaline phosphatase(AP)of total intestinal segments of large yellow croaker larvae fed the experimental micro-diet for 30 d

3 讨论

本实验发现,在基础饲料中添加谷氨酰胺未对大黄鱼稚鱼的生长、存活及消化酶活力

产生显著影响,但有提高稚鱼生长和存活的趋势。杨奇慧[26]在罗非鱼幼鱼中得到了和本实验相似的研究结果,饲料中添加谷氨酰胺对杂交罗非鱼的增重率、特异生长率、成活率及饲料系数均无显著影响(P> 0.05)。然而,与本实验不同,以往研究发现饲料中添加谷氨酰胺可以促进陆生动物肠道发育和提高消化酶活力[6,8-9,27-28]。在鱼类中也观察到了和本实验结果相反的实验结果,在饲料中添加谷氨酰胺可以促进建鲤幼鱼的生长和摄食,且鱼肠道蛋白酶和脂肪酶活力随饲料谷氨酰胺添加量上升而提高[11]。建鲤肠道消化酶活力的提高可能与谷氨酰胺提高了幼鱼肝胰脏的发育有关,摄食谷氨酰胺饲料组建鲤的肝指数和肝胰脏蛋白质含量均高于对照组[11]。

本实验未观察到谷氨酰胺的促生长等作用效果,可能因为谷氨酰胺对动物的作用效果存在剂量相关性。体外实验发现,0.5 mmol/L谷氨酰胺诱发了鼠杂交瘤细胞核糖核苷酸的合成,但是在0.5～9 mmol/L谷氨酰胺水平内无显著差异[29]。过氧化氢氧化压力培养基中添加4 mmol/L谷氨酰胺即可为肠上皮细胞提供足够的保护,谷氨酰胺浓度的提高未产生更好的保护效果[30]。Lin和Zhou[11]研究发现饲料中添加谷氨酰胺显著提高了建鲤幼鱼体增重、摄食量、肠重量、肠绒毛高度和消化酶活力,各参数随饲料谷氨酰胺添加量的提高有先上升然后稳定的趋势。较高含量的谷氨酰胺未能发挥更好的作用可能因为细胞或者动物利用高浓度谷氨酰胺能力有限[29]。动物不能充分利用高含量的谷氨酰胺可能与谷氨酰胺运输能力有限和谷氨酰胺代谢酶活力低且反应滞后有关[31-34]。本实验中,为满足稚鱼的营养需求基础饲料中添加了76%的优质蛋白源,其中包括48%的低温干燥鱼粉和3%的鱼肉水解蛋白,这些蛋白源中可能已经含有达到或超过稚鱼利用能力阈值的谷氨酰胺,所以额外添加的谷氨酰胺未被充分利用而未表现出作用效果。

动物对谷氨酰胺的需要还具有种属差异性。谷氨酰胺是哺乳动物淋巴细胞培养基必需的,是哺乳动物白细胞进行有丝分裂的必需物质[35-36]。但是谷氨酰胺不是鱼类细胞增殖必需的,甚至可能抑制鱼类细胞的增殖[37]。Ganassin等[38]发现,在培养基中添加谷氨酰胺能抑制虹鳟白血球凝集素诱发的增殖,此外研究发现石斑鱼也不需要谷氨酰胺对有丝分裂反应[39]。而Rosenberg-Wiser和Avtalion[40]发现8 mmol/L谷氨酰胺促进了鲤白细胞植物凝集素诱发的增殖。奇努克鲑鱼胚胎细胞系CHSE对谷氨酰胺表现出条件需要特性,在基本培养基MEM中谷氨酰胺促进了胚胎细胞的增殖,而在L-15培养基中,谷氨酰胺抑制了细胞的生长[37]。目前,谷氨酰胺的作用效果在哺乳动物中已被广泛的证实,但是在鱼类研究较少,其对鱼类细胞增殖、肠道发育及鱼类生长等的作用效果和作用机制仍需要深入研究。

本实验条件下,在饲料中添加谷氨酰胺未对大黄鱼稚鱼的生长、存活和消化酶活力产生显著的影响。表明,本基础饲料配方足以满足大黄鱼稚鱼正常生长发育的营养需要,无需额外补充谷氨酰胺。

致谢:本实验的养殖和分析过程中得到了谢奉军、程镇燕和李庆飞的大力协助,在此表示感谢。

[1] Krebs H A,Baverel G,Lund P.Effect of bicarbonate on glutamine metabolism[J].Int J Biochem,1980,12:69-73.

[2] Souba W W.Intestinal glutamine metabolism and nut ration[J].J Nutr Biochem,1993,4:2-9.

[3] Wu G,Flynn N E,Yan W,et al.Glutamine metabolism in chick enterocytes:absence of pyrroline-5-carboxylase synthase and citrulline synthesis[J].Biochem J,1995,306:717-721.

[4] Co ffier M,D chelotte P.The role of glutamine in intensive care unit patients:mechanisms of action and clinical outcome[J].Nutr Rev,2005,63:65-69.

[5] Diestel C F,Marques R G,Lopes Paulo F,et al.L-Glutamine supplementation optimizes the repair of the colonic mucosa in rats subjected to abdominal irradiation[J].Nutr Res,2007,27:647-652.

[6] 张军民,高振川,王连娣,等.日粮添加谷氨酰胺对早期断奶仔猪小肠酶的影响[J].动物营养学报,2001,13(4):18-23.

[7] Salloum E,Flamant F,Rey A,et al.Rhabdomyosarcoma in infants under one year of age:experience of the Institut Gustave-Roussy[J].Med Pediatr Oncol,1989,17:424-428.

[8] Helton W S,Jacobs D O,Bonner-Weir S.Effects of glutamine-enriched parenteral nutrition on the exocrine pancreas[J].J Parenter Enteral Nutr,1990a,14:344-352.

[9] Helton W S,Smith R J,Rounds J,et al.Glutamine prevents pancreatic atrophy and fatty liver during elemental feeding[J].J Surg Res,1990b,48:297-303.

[10] Tannuri U F,Carrazza R,Iriya K.Effects of glutamine supplemented diet on the intestinal mucosa of the malnourished growing rat[J].Rev Hosp Clin,2000,55:87-92.

[11] Lin Y,Zhou X Q.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp(Cyprinus carpiovar.Jian)[J].Aquaculture,2006,256:389-394.

[12] 刘峰,麦康森,艾庆辉,等.鱼肉水解蛋白对大黄鱼稚鱼存活、生长以及体组成的影响[J].水产学报,2006,30(4):502-508.

[13] 赵金柱,艾庆辉,麦康森,等.微粒饲料替代生物饵料对大黄鱼稚鱼生长、存活和消化酶活力的影响[J].水产学报,2008,32 (1):91-97.

[14] 于海瑞.大黄鱼仔、稚鱼营养生理及其开口饲料的开发研究[D].青岛:中国海洋大学,2003.

[15] 于海瑞.大黄鱼仔稚鱼消化生理、蛋白质和蛋氨酸需要量的研究[D].青岛:中国海洋大学,2006.

[16] 刘峰.大黄鱼和半滑舌鳎仔稚鱼人工微颗粒饲料蛋白源选择及其加工工艺相关研究[D].青岛:中国海洋大学,2007.

[17] 赵金柱.大黄鱼仔稚鱼脂类营养生理的研究[D].青岛:中国海洋大学,2007.

[18] Klimberg V S,Salloum R M,Kasper M,et al.Oral glutamine accelerates healing of the small intestine and improves outcome after whole abdominal radiation[J].Arch Surg,1990,125: 1040-1045.

[19] Association of Official Analytical Chemists(AOAC).Official methods of analysis of AOAC international.Vol.I.Agriculture Chemical;Contaminants,Drug.16th edn.AOAC International [M].Arlington,VA.1995.

[20] Cahu C,Zambonino Infante J L.Early weaning of sea bassDicentrarchus labraxlarvae with a compound diet:effect on digestive enzymes[J].Comp Biochem Physiol,1994,109A:213-222

[21] Holm H,Hanssen L E,Krogdahl A,et al.High and low inhibitor soybean meals affect human duodenal proteinase activity differently:in vivo comparison with bovine serum albumin[J].J Nutr,1988,118:515-520

[22] Métais P,Bieth J.Determination de l’α-amylase parune microtechnique[J].Ann Biol Clin,1968,26:133-142.

[23] Bessey O A,Lowry O H,Brock M J.Rapid coloric method for determination of alkaline phosphatase in five cubic millimeters of serum[J].J Biol Chem,1946,164:321-329.

[24] Maroux S,Louvard D,Baratti J.The aminopeptidase from hogintestinal brush border[J].Biochim Biophys Acta,1973,321: 282-295.

[25] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[26] 杨奇慧,周歧存,谭北平,等.谷氨酰胺对杂交罗非鱼生长、饲料利用及抗病力的影响[J].中国水产科学,2008,15(6):1016-1023.

[27] Wu G,Meier S A,Knabe D A.Dietary glutamine supplementation prevents jejunal atrophy in weaned pigs[J].J Nutr,1996, 126:2578-2585.

[28] Murnin M,Kumar A,Li G D,et al.Effects of glutamine isomers on human(Caco-2)intestinal epithelial proliferation,strainresponsiveness,and differentiation[J].JGastrointest Surg, 2000,4:435-442.

[29] Barnab N,Butler M.The effect of glucose and glutamine on the intracellular nucleotide pool and oxygen uptake rate of a murine hybridoma[J].Cytotechnology,2000,34:47-57.

[30] Chen J,Zhou X Q,Feng L,et al.Effects of glutamine on hydrogen peroxide-induced oxidative damage in intestinal epithelial cells of Jian carp(Cyprinus carpiovar.Jian)[J].Aquaculture, 2009,288:285-289.

[31] Glacken M W.Catabolic control of mammalian cell culture[J]. Bio/Technology,1988,6:1041-1050.

[32] Sri-Pathmanathan R M,Braddock P,Brindle K M.31PNMR studies of glucose and glutamine metabolism in cultured mammalian cells[J].Biochim Biophys Acta,1990,1051:131-137.

[33] Fitzpatrick L,Jenkins H A,Butler M.Glucose and glutamine metabolism of a murine B-lymphocyte hybridoma grown in batch culture[J].Appl Biochem Biotechnol,1993,43:93-116.

[34] Neermann J,Wagner R.Comparative analysis of glucose and glutamine metabolism in transformed mammalian cell lines,insect and primary liver cells[J].J Cell Physiol,1996,166:152-169. [35] CrawfordJ,Cohen H J.The essential role of L-glutamine in lymphocyte differentiationin vitro[J].J Cell Physiol,1985,24: 275-282.

[36] Griffths M,Keast D.The effect of glutamine on murine splenic leucocyte responses to T and B cell mitogens[J].Immunol Cell Biol,1990,68:405-408.

[37] Bols N C,Ganassin R C,Tom D J,et al.Growth of fish cell lines in glutamine-free media[J].Cytotechnology,1994,16: 159-166.

[38] Ganassin R C,Barlow J,Bols N.Influence of glutamine on phytohemagglutinin stimulated mitogenesis of leucocytes from the rainbow trout head kidney[J].Fish Shellfish Immunol,1998,8: 561-564.

[39] McBride S,Keast D.Mitogenesis of snapper lymphocytes and their requirement for glutamine[C].Abstract AP2,7th Congress of the ISDCI,Dev Comp Immunol.1997,21:91.

[40] Rosenberg-Wiser S,Avtalion R R.The cells involved in the immune response of fish.III.Culture requirements of PHA-stimulated carp(Cyprinus carpio)lymphocytes[J].Dev Comp Immunol,1982,6:693-702.

Abstract: Four experimental micro-diets supplemented with 0.00%(control),0.60%,1.20%and 1.80%glutamine were fed to large yellow croaker larvae(15days post hatch,initial body weight 2.75± 0.31 mg)for 30 days to investigate the effects of glutamine on growth,survival and activities of selected digestive enzyme of larvae.Glycine was used to adjust the level of crude protein to be about 58%,and crude lipid were about 16%in the diets.The results showed that specific growth rate and survival of large yellow croaker larvae increased with the supplementation of glutamine,but no significant difference was observed among dietary treatments(P>0.05).There were no significant differences in activities of amylase and trypsin in intestinal or pancreatic segments,alkaline phosphatase and aminopeptidase N in intestinal segments among fish fed different diets(P>0.05).In this experiment,dietary glutamine didn’t show significant influence on growth,survival and activities of digestive enzyme of large yellow croaker larvae. This may be related to the content of glutamine contained in fish meal,hydrolysated fish meal and other protein sources in the diets,which perhaps had satisfied or exceeded the limit that the larvae could absorb and utilize.So additional glutamine supplementation could not be absorbed and utilized to perform the effects.The results showed that the basal diet could satisfy the nutrition requirement of the larvae,and no more additional glutamine was required by large yellow croaker larvae.

Key words: large yellow croaker larvae;Glutamine;growth;survival;activities of digestive enzymes

责任编辑 于 卫

Effects of Dietary Glutamine on Growth,Survival and Activities of Selected Digested Enzymes of Large Yellow Croaker(Pseudosciaena crocea)Larvae

GAO Jin,AI Qing-Hui,MAI Kang-Sen
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education;College of Fishery,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S963.73+1

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-049-06

国家自然科学基金项目(30400335)资助

2010-04-08;

2010-06-23

高 进(1985-),男,硕士生;主要从事水产动物营养生理研究。E-mail:jingao851227@163.com

E-mail:qhai@ouc.edu.cn