膜技术分离金银花绿原酸提取液工艺研究

范远景，马凌云，徐晓伟，张 平，方桐辉，胡晓薇

(1. 合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.安徽省祁门黄山药谷科技有限公司，安徽 祁门 245600)

膜技术分离金银花绿原酸提取液工艺研究

范远景1，马凌云1，徐晓伟1，张 平2，方桐辉2，胡晓薇2

(1. 合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.安徽省祁门黄山药谷科技有限公司，安徽 祁门 245600)

研究膜技术分离纯化绿原酸提取液的过程。以金银花为原料，以平均通量、膜截留率、绿原酸透过率为指标，比较3种微滤膜MF1、MF2和MF3，4种超滤膜UF1、UF2、UF3和UF4，及两种反渗透膜RO1和RO2对绿原酸提取液的过滤特性，并研究浓缩液的洗滤对绿原酸截留率的影响。结果表明：MF1、UF1和RO2膜的过滤性能明显优于其他同类型膜，使用MF1-UF1-RO2膜组合处理效果最佳，其绿原酸回收率可达67.75%，产品纯度可达13.21%以上；同时，洗滤可进一步提高处理效果，经间歇洗滤后，MF1膜的绿原酸截留率可由9.54%降低到1.17%，UF2膜的绿原酸截留率可由32.36%降低到20.11%。

金银花；绿原酸；膜技术；超滤

金银花(Lonicera japonicaThunb)为我国传统中药材，是重要的药食两用植物原料[1-3]。绿原酸(chlorogenic acid，CA)是金银花的主要药用成分，具有清除体内自由基、抗氧化、抑制突变、抗肿瘤、保护心血管、保肝利胆、抗菌、抗病毒等作用[4-9]，因而应用极为广泛。目前提取和纯化绿原酸方法有水提醇沉法、醇提铅盐沉淀法、聚酰胺柱层析法、酶法等多种，但这些方法存在提取率低、对绿原酸的破坏大、处理量小、工艺过程长、产品纯度低、卫生安全性差和成本高的缺点。与此相比，膜分离技术作为一种新型高效、精密的分离技术，因其高效分离、设备简单、节能、常温操作、无污染等优点而得到越来越广泛的应用[10-17]。因此在深入分析金银花提取液的成分种类、结构、理化性质和膜技术特点的基础上，本实验对使用微滤分离固体微粒、用超滤除去大分子物质、用反渗透浓缩的膜技术工艺处理绿原酸提取液以达到分离纯化和浓缩绿原酸提取液目的的处理工艺进行研究，以期得到更可行的绿原酸工业生产的方案，拟为后期制备中、高纯度绿原酸创造条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花 安徽省祁门“黄山药谷”有限生物科技有限公司。

微滤膜为聚偏氟乙烯膜，超滤膜为聚砜膜，反渗透膜为醋酸纤维素酯膜。

氢氧化钠(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、冰醋酸(一级色谱纯) 上海中试化工总公司；甲醇(一级色谱纯)天津四友精细化学品有限公司；绿原酸对照品(纯度≥95%) Sigma公司。

1.2 仪器与设备

FC104型电子天平 上海精科有限公司； H-H-4数显电热恒温水浴锅 江苏金坛市宏华仪器厂；LC982型高效液相色谱仪 北京温分分析仪器技术开发有限公司；YHG-9202-2型红外干燥箱 上海三发科学仪器有限公司；试验型微滤膜分离设备(含多种膜组件) 合肥风云膜分离技术有限公司；试验型多功能膜分离设备(含多种膜组件) 合肥世杰膜工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

金银花→粉碎过40目筛→水浸提→绿原酸水提液→冷沉24h后过滤→微滤→超滤→反渗透浓缩

水浸提条件：料液比1:20(m/V)，90℃提取45min，浸提3次；冷沉条件：室温，24h；微滤、超滤均经间歇水洗，每次10kg，重复3次。

1.3.2 绿原酸提取液的制备

取金银花适量，40℃干燥至质量恒定后粉碎过40目筛，按1:20(m/V)料液比加水浸泡1h后在90℃恒温浸提45min，重复3次，合并提取液，冷沉24h后过200目筛，即得。

1.3.3 绿原酸提取液的微滤处理

取绿原酸提取液适量，分别选用MF1、MF2和MF3膜对其进行微滤处理，以除去不溶性固体颗粒及少量大分子物质。在该阶段实验中，分别精确测量或测定MF1、MF2和MF3膜处理后的截留液、透过液的体积、瞬时膜通量、固形物含量和绿原酸含量，计算MF1、MF2和MF3膜的平均通量、膜截留率、CA透过率，根据以上工艺指标选择合适的微滤膜。

1.3.4 微滤透液的超滤

经MF1膜微滤处理后的绿原酸透过液，分别选用UF1、UF2、UF3和UF4对其进行膜处理，以去除如蛋白质、多糖(淀粉、纤维素等)、鞣质或其复合物等大分子物质及胶体物质。在该阶段实验中，同样分别精确测量、测定并计算UF1、UF2、UF3和UF4处理后的截留液、透过液的上述工艺指标，根据以上指标选择合适的超滤膜。

1.3.5 超滤透过液的反渗透浓缩

经超滤处理后的绿原酸透过液，分别选用RO1和RO2反渗透膜对其进行浓缩处理，以浓缩料液及除去少量小分子物质。在该实验中，根据其平均通量大小及有无绿原酸渗漏的工艺指标选择适当的反渗透膜。

1.3.6 最适膜组合的选择

分别选取MF1-UF1-RO2、MF1-UF4-RO2、MF3-UF4-RO2、MF2-UF2-RO2膜组合对绿原酸提取液进行处理，考察并比较各个膜组合处理所得浓缩液中的CA纯度(干物质)、CA收率和各个膜组合的总截留率(截留相对分子质量：MF1＞MF2＞MF3＞UF1＞UF2＞UF3＞UF4＞RO1＞RO2)。

1.3.7 洗滤对膜处理效果的影响

分别取绿原酸提取液原液和经MF1膜处理后的绿原酸透液各2份，分别用MF1和UF1膜进行膜处理。对其中一个微滤过程和一个超滤过程进行间歇洗滤，即将膜截留液以原液1/2体积纯水进行洗滤(每次添加10L)，其余不洗滤，分别测量并计算各个膜处理过程的膜截留率、CA截留率、CA纯度和CA收率等工艺指标，考察其变化。

1.4 测定与分析方法

1.4.1 瞬时膜通量的测定

在膜处理过程中，使用量筒接取10s左右的透过液，准确读取其体积，记录所用时间，结合所使用的膜的膜面积，计算瞬时膜通量。平均膜通量为瞬时膜通量的算术平均值。

1.4.2 膜截留率、绿原酸透过率和绿原酸截留率的测定

在膜分离过程中，分别精确测量相应的原液、截留液和透过液的体积，并测定其绿原酸含量、固形物含量，分别计算相应膜截留率、绿原酸透过率和绿原酸截留率。

CA截留率(A)=1－CA透过率

CA纯度/%=绿原酸的质量浓度/总固形物×100

CA收率/%=反渗透截留液中绿原酸总量/膜处理前原提取液中绿原酸总量×100

式中：R1为膜截留率；R2为绿原酸透过率；A为绿原酸截留率；w0为该膜处理过程起始液固形物含量/(g/L)；w1为截留液固形物含量/(g/L)；v0为该膜处理过程起始液体积/L；V1为截留液体积/L；V2为透过液的体积/L；c0为膜处理过程起始液绿原酸质量浓度/(mg/L)；c2为透过液中绿原酸质量浓度/(mg/L)。

1.4.3 HPLC法测定绿原酸含量

1.4.3.1 色谱条件

LC98Ⅱ型高效液相色谱仪，Kromasil ODS C1815μm色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(40:60，V/V)(含1%冰醋酸)；流速：0.3mL/min；检测波长：327nm，进样量20μL。

1.4.3.2 绿原酸含量测定

以标品配制的不同浓度的对照品进样，以绿原酸浓度为横坐标，以所得峰面积为纵坐标作标准曲线。处理数据得回归方程为y=98667969.43x－142638.23，RSD=0.997%。根据标准曲线计算绿原酸含量。

1.4.4 固形物含量测定

将膜分离过程中各阶段的物料各精确取样，置干燥箱中，105℃恒温干燥至质量恒定，测定。

2 结果与分析

2.1 微滤膜的选择

由于金银花在水浸提过程中长时间受热，其组织结构已部分解体，所以绿原酸提取液中含有少量固体微粒和大量大分子物质，难以除去。微孔过滤是除去不溶性固体微粒和大分子物质的有效方法，但微滤膜截留相对分子质量不同，微滤膜的通量、膜截留率和对绿原酸透过率可能会有很大的不同。微滤膜MF1、MF2 、MF3处理绿原酸提取液的情况见表1。由表1可知，三道微滤膜的膜截留率较为接近、差别不大，但MF1膜的平均通量和绿原酸透过率却均高于MF2和MF3膜。这是因为MF1膜的截留相对分子质量较大，膜孔较大，不易导致浓差级化，对绿原酸透过率影响较小的缘故。所以微滤过程应选用MF1膜。

表1 3种微滤膜处理效果比较Table 1 Comparison of applications of three microfiltration membranes

2.2 超滤膜的选择

由于微滤透液中仍含有大量大分子物质及胶体物质、绿原酸纯度较低，所以应继续纯化。超滤是除去提取液中的大分子物质及胶体物质，使溶液澄清化的好方法。但超滤膜截留相对分子质量的不同，超滤的通量和过程的有效性会有差异，超滤膜UF1、UF2、UF3和UF4处理MF1微滤透过液的效果见表2。由表2可知，UF1膜的平均通量和绿原酸透过率均高于其他膜，但膜截留率则相对较低。可能是因为杂质在UF2、UF3、UF4膜截留相对分子质量附近分布较为集中，从而更容易导致浓差极化，进而影响平均通量、膜截留率和绿原酸透过率；同时UF1膜截留相对分子质量较大、膜孔径较大的缘故。故超滤实验选用UF1膜为宜。

表2 4种超滤膜处理效果比较Table 2 Comparison of applications of four ultrafiltration membranes

2.3 反渗透膜的选择

反渗透可以脱除提取液中的水分，从而达到浓缩提取液富集绿原酸的目的。反渗透膜的截留相对分子质量大小不同对反渗透过程的膜通量和绿原酸的截留率会产生不同的影响。由于目标物质绿原酸的相对分子质量也较小，所以在反渗透膜处理的过程中可能会有泄露，应予避免。RO1和RO2反渗透膜处理超滤透液的情况见表3。由表3可知，RO1和RO2两道反渗透膜的膜截留率和平均通量均十分接近，但RO1膜有绿原酸渗漏情况发生(通过透过液监控检测)，这是因为RO1膜的截留相对分子质量和膜孔径相对较大的缘故。所以反渗透实验选用RO2膜为宜。

表3 RO1、RO2膜处理效果比较Table 3 Comparison of applications of two reverse osmosis membranes

2.4 膜处理工艺的选择

上述实验表明，选用MF1-UF1-RO2的膜组合过滤，其绿原酸纯度和绿原酸收率均明显优于其他膜组合。使用MF1-UF1-RO2的膜组合过滤，绿原收率为67.75%，绿原酸纯度为13.21%，膜总截留率为39.25%。所以金银花绿原酸提取液的分离纯化应选用MF1-UF1-RO2膜组合。

2.5 洗滤对膜处理效果的影响

在膜分离过程中，当截留液体积小到不足以形成回流时，膜分离过程就不能进行。但此时浓缩液中还含有较高浓度的绿原酸，为了充分利用原料，采用截留液加纯水稀释以形成膜回流的工艺是必要的。间歇加入1/2浓缩液体积的纯水进行洗滤前后，MF1和UF1膜的绿原酸截留率见表4。由表4数据可知，微滤、超滤的截留液经过间歇洗滤后，膜对绿原酸的截留率均明显降低了，尤其是微滤膜MF1的截留液经间歇洗滤后其绿原酸截留率大幅度降低，由未洗滤前的9.54%降至1.17%。

表4 洗滤前后膜截留率和绿原酸截留率Table 4 Effect of diafiltration on MF1 and UF2 separations

3 结 论

实验结果表明，在同类型膜中MF1膜、UF1膜和RO2膜效果较好；使用MF1-UF1-RO2膜组合完全可以达到大规模初步分离绿原酸的目的，且效果较佳，其绿原酸收率可达67.75%，产品纯度可达13.21%。同时，结合洗滤可进一步提高处理效果。但反渗透浓缩液中的绿原酸含量虽然很高，其中却存在大量的与绿原酸结构相似、相对分子量相近、性质也近似的黄酮、酚酸等类物质，会影响产品CA纯度含量等问题将进一步实验研究。综上所述，在膜技术分离浸提原液的基础上，在制品将进行柱层析分离技术进一步纯化获得中、高含量绿原酸产品是实现工业规模化生产、满足市场不同绿原酸纯度产品要求的可行思路。

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Application of Membrane Separation for the Purification of Chlorogenic Acid-rich Extract fromLonicera japonicaThunb.

FAN Yuan-jing1，MA Ling-yun1，XU Xiao-wei1， ZHANG Ping2，FANG Tong-hui2，HU Xiao-wei2
(1. College of Biotechnology and Food Engineeing, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；
2. Anhui Huangshan Herb Valley Bio-Technology Co. Ltd., Qimen 245600, China)

In terms of average membrane permeation flux, membrane retention rate and permeation rate of chlorogenic acid, the applications of three microfiltration membranes (MF1, MF2 and MF3), four ultrafiltration membranes (UF1, UF2, UF3 and UF4) and two reverse osmosis membranes (RO1 and RO2) for the purification of the chlorogenic acid-rich extract fromLonicera japonicaThunb were evaluated. MF1, UF1 and RO2 were found to be even better than other similar membranes. Optimal purification was achieved by the sequential combined use of MF1, UF1 and RO2, and the maximum chlorogenic acid recovery was up to 67.75%, and a product with a purity exceeding 13.21% was obtained. Additionally, diafiltration could improve the treatment effect, and the retention rate of chlorogenic acid was decreased from 9.54% to 1.17% in MF1 separation and from 32.36%to 20.11% in UF2 separation after intermittent diafiltration.

Lonicera japonicaThunb；chlorogenic acid；membrane technology；ultrafiltration

TS201.1

A

1002-6630(2010)20-0043-04

2010-02-06

黄山市重点科技项目(2009ZN-09)

范远景(1958—)，男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：swf89105@mail.hf.ah.cn