壳聚糖-海藻酸钠叶绿素亚铁微胶囊的制备及缓释性能研究

孟庆廷，陈万东

(济宁学院化学与化工系，山东 济宁 273155)

壳聚糖-海藻酸钠叶绿素亚铁微胶囊的制备及缓释性能研究

孟庆廷，陈万东

(济宁学院化学与化工系，山东 济宁 273155)

用壳聚糖-海藻酸钠微囊技术制备一系列叶绿素亚铁微胶囊，以包封率和载药量作为制备工艺优化指标，通过正交试验得出最优方案。考察微胶囊在模拟胃液和模拟肠液中的控制释放效果。结果显示，制备该微胶囊的最优方案为海藻酸钠15mg/mL、壳聚糖4mg/mL、氯化钙20mg/mL、芯材与海藻酸钠的质量比1:4。所得胶囊在模拟胃液和模拟肠液中缓释性能良好。

壳聚糖-海藻酸钠叶绿素亚铁微胶囊；载药量；包封率；缓释

叶绿素亚铁是一种具有补铁保健功能的天然绿色色素，除了能够用于铁强化剂，治疗缺铁性贫血外，还可用作一些慢性病的辅助治疗。叶绿素亚铁具有抗菌、抗病毒、抗过敏和促进组织再生等作用，是一种良好的造血细胞复合剂，对各种原因引起的白细胞减少症及各种贫血有治疗作用[1]，其补铁效果优于叶绿素铁[2]。但叶绿素亚铁的稳定性较差，尤其在光照、高温等条件下[3-4]。微胶囊化可以减轻外界环境对敏感芯材的影响程度，增加易氧化、易挥发、光敏性和热敏性物料的稳定性等，从而提高其储存性能，改善可操作性[5-6]。壳聚糖和海藻酸钠的生物相容性和降解性好，无毒副作用，是良好的药物缓释剂[7]。应用壳聚糖、海藻酸钠为壁材制备微胶囊，所得产物的包封率高[8-9]，缓释效果明显[10]，并且可有效地增加芯材的可吸收性，降低芯材的副作用[11]。

本实验利用壳聚糖和海藻酸钠作材料，对制备叶绿素亚铁微胶囊的工艺以及微胶囊在模拟胃液和模拟肠液中的缓释性进行了研究，旨在为叶绿素亚铁的研究与应用提供一些有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖(黏度35CPS，脱乙酰度92.8%)；海藻酸钠(化学纯)；叶绿素亚铁(由大蒜叶自制，纯度98.7%)；氯化钙、氢氧化钠、醋酸、浓盐酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯；PBS(0.5mol/L，pH7.2)；胃蛋白酶(4000U/mg)、胰蛋白酶(2500U/mg) 上海东风生化试剂厂。

1.2 仪器与设备

723型可见分光光度计 上海精密科学仪器厂；DZF-6020型干燥箱 嘉兴中新医疗仪器有限公司； PHSP1型精密pH计 上海大中分析仪器厂；SHZ-Q型水浴恒温振荡器 常州市伟嘉仪器制造有限公司；800型高速离心机 上海手术医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 制备工艺

称取适量CaCl2，以1.0%乙酸溶解并稀释成20mg/mL的CaCl2溶液。取适量壳聚糖，以上述氯化钙溶液溶解，用0.10mol/L NaOH调节溶液pH值为5.5[12]。配制一定质量浓度的叶绿素亚铁溶液，并以一定比例的海藻酸钠溶于其中。取4mL叶绿素亚铁的海藻酸钠溶液，用带8号针头的5mL注射器缓慢滴至盛有20mL的壳聚糖氯化钙溶液中，滴加高度20mm，滴完后静置30min，过滤并用水洗涤3次，收集微球，真空干燥。

1.3.2 叶绿素亚铁含量的测定

1.3.2.1 绘制标准曲线

产品的吸收曲线：配制一定质量浓度的叶绿素亚铁盐溶液，用分光光度计对产品进行扫描，在404nm和655nm波长处有两处吸收峰。测定采用最大吸收峰404nm。

绘制标准曲线：以PBS溶液先配制质量浓度0.1000mg/mL标准母液，然后分别移取0、1、2、3、4、5mL分别放入25mL容量瓶中，用PBS液定容为0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00μg/mL标准系列溶液。以PBS溶液为参比，用分光光度计以1cm比色皿于404nm处分别测定吸光度。以叶绿素亚铁质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出吸光度-叶绿素亚铁含量标准曲线(图1)。

1.3.2.2 样品叶绿素亚铁总量测定

精确称取叶绿素亚铁微胶囊1.000g，溶于PBS缓冲溶液中，振荡器上破碎12h，低温高速离心以除去壳聚糖、海藻酸钠和残渣，取上层液，测定吸光度，对照标准曲线，求得叶绿素亚铁的含量。

1.3.2.3 表面叶绿素亚铁量测定

精确称取0.5000g样品，加入少量去离子水轻轻搅拌，洗去表面叶绿素亚铁，离心分离，收集上层清液，重复该步骤2次，合并上清液，定容至50mL，过滤。测定方法同1.3.2.2节。

1.3.3 评估指数的选取

以包封率(encapsulated efficiency，EE)、载药量(drug loading，DL)为指标综合评价实验结果以优化处方，评估指数(evaluating indicator，EI)为：

1.3.4 微胶囊的体外释放实验

1.3.4.1 在模拟胃液环境中的释放

在50mL模拟胃液[13](200g NaCl、3.2g 胃蛋白酶、7.0mL浓盐酸、双蒸水定容于1000mL。pH值约为1.2)中加入一定量已干燥的胶囊，温度37℃，转速60r/min，在指定时间取样，检测叶绿素亚铁含量，计算模拟胃液中释放率。

1.3.4.2 在模拟肠液环境中的释放

在上述胃液模拟液中处理一定时间的微胶囊，分离后水洗，加入50mL肠液模拟液[13](称取6.8g KH2PO4溶于约500mL水中，另称取l0g胰蛋白酶加水溶解，定容至1000mL，NaOH调节pH7.6)，温度37℃，60r/min，在指定时间取样，检测叶绿素亚铁含量，计算模拟肠液中释放率。

2 结果与分析

2.1 叶绿素亚铁盐的标准曲线

测得叶绿素亚铁含量(x)和吸光度(y)之间的关系如图1所示，线性回归方程为y=0.0816x－0.0004，R2=0.9997，线性较好，可用于叶绿素亚铁的定量测定。

图1 叶绿素亚铁标准曲线Fig.1 Standard curve of sodium- iron(Ⅱ) chlorophyllin

2.2 海藻酸钠质量浓度对微胶囊的影响

保持氯化钙的质量浓度20mg/mL、壳聚糖质量浓度4mg/mL、叶绿素亚铁:海藻酸钠为1:4(m/m)，采用不同质量浓度的海藻酸钠制备一系列微胶囊，结果见图2。

图2 海藻酸钠质量浓度对包封率和载药量的影响Fig.2 Effect of sodium alginate concentration on entrapment efficiency and drug loading

由图2可知，当海藻酸钠质量浓度小于20mg/mL时，微胶囊的载药量和包封率随着海藻酸钠质量浓度的增大而增大，之后随着海藻酸钠质量浓度的增大而减小。这可能是由于海藻酸钠质量浓度太低时，壳聚糖-海藻酸钠聚电解质膜过薄，不能形成微球，或形成的微球机械强度低，不能有效地对芯材进行包埋；海藻酸钠质量浓度过高，体系黏度大，包埋效果也不好[14]。

2.3 壳聚糖质量浓度对微胶囊的影响

保持海藻酸钠质量浓度为15mg/mL、氯化钙质量浓度为20mg/mL、芯材与海藻酸钠质量之比为1:4不变，采用不同质量浓度的壳聚糖制备系列微胶囊，结果如图3所示。

图3 壳聚糖质量浓度对包封率和载药量的影响Fig.3 Effect of chitosan concentration on entrapment efficiency and drug loading

从图3可以看出，随着壳聚糖质量浓度的增大，微胶囊的包封率和载药量呈增加的趋势，但当壳聚糖质量浓度超过4mg/mL时，包封率及载药量反而有所下降。当壳聚糖质量浓度为4mg/mL时，微胶囊的包封率以及载药量都达到最佳水平。

2.4 氯化钙质量浓度对微胶囊的影响

保持壳聚糖的质量浓度4mg/mL、海藻酸钠的质量浓度15mg/mL、芯材:海藻酸钠为1:4，采用不同质量浓度氯化钙制备一系列微胶囊，结果如图4所示。

图4 氯化钙质量浓度对包封率和载药量的影响Fig.4 Effect of CaCl2 concentration on entrapment efficiency and drug loading

由图4可知，随着氯化钙质量浓度的增大包封率及载药量均提高。但是，当氯化钙质量浓度超过15mg/mL后，这两个方面反而下降，这表明较高的氯化钙质量浓度则会降低包封率和载药量。这与Sezer 等[15]的研究结果一致。

2.5 芯材与海藻酸钠的比例对微胶囊的影响

图5 芯材壁材质量比对包封率和载药量的影响Fig.5 Effect of core material/wall material ratio on entrapment efficiency and drug loading

保持其他条件不变，采用不同比例的叶绿素亚铁与海藻酸钠制备微胶囊，所得产物的结果如图5所示。随着海藻酸钠与芯材质量比的增大，载药率逐渐减小，包封率逐渐增大。海藻酸钠与芯材比增大，一方面增强了微球对芯材的包封能力，使包封率增大，另一方面增加了微球的质量，故使载药率下降。

2.6 正交试验确定最佳条件

为了确定叶绿素亚铁微胶囊制备的最佳条件，选取海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度、氯化钙质量浓度、叶绿素亚铁与海藻酸钠质量比作为主要的考察因素，以微胶囊评估指数为考察指标进行正交试验，结果见表1。

在4种因素中，对评估指数影响的程度大小为D＞A＞C＞B，综合多种制备因素，选择最佳微胶囊制备条件为A1B2C3D3，即海藻酸钠质量浓度15mg/mL、壳聚糖质量浓度4mg/mL、氯化钙质量浓度20mg/mL、芯材与海藻酸钠质量之比为1:4。

表1 正交试验结果Table 1 Orthogonal array design arrangement and experimental results

2.7 微胶囊的体外释放实验结果

在最优化条件下制备叶绿素亚铁微胶囊，并在模拟胃液和模拟肠液环境中进行体外释放实验，在模拟肠液环境中的释放情况是在模拟胃液环境中处理60min后进行的。结果见图6、7。

图6 叶绿素亚铁微胶囊在模拟胃液中的释放情况Fig.6 Time course of sustained release of chitosan-sodium alginate sodium-sodium ferrous chlorophyllin microcapsules in mimic gastric environment

图7 叶绿素亚铁微胶囊在模拟肠液环境中的释放情况Fig.7 Time course of sustained release of chitosan-sodium alginate sodiumsodium ferrous chlorophyllin microcapsules in mimic intestinal environment

由图6、7可见，在模拟胃液环境中停留60min后，微胶囊中芯材的释放率即达32%。说明在酸性条件下，微胶囊表面的壳聚糖膜及壳聚糖与海藻酸钠的复合膜易于遭到破坏，导致内容物释放。在酸性溶液中停留时间越长，微胶囊的控释能力越低。若在模拟胃液环境中处理60min后，在模拟肠液环境中120min累计释放率可达60%。

3 结 论

壳聚糖性质稳定，具有良好的生物可降解性和相容性，毒性极小(LD50为16g/kg)。海藻酸钠不仅是一种安全的食品添加剂，而且可作为仿生食品或疗效食品的基材，它在肠道中能抑制有害金属如锶、镉、铅等在体内的积累[16]。壳聚糖与海藻酸钠载体制备条件温和，不需要有机溶剂，适合于有生物活性的蛋白质类药物以及稳定性较差的芯材。壳聚糖与海藻酸钠微囊法应用于叶绿素亚铁的包封，其制备简单快速，包封率好。制备的微囊在模拟胃液和模拟肠液中缓释性能良好。正交试验结果表明叶绿素亚铁与海藻酸钠的质量比对微胶囊的影响最大，制备微胶囊的最佳条件为海藻酸钠质量浓度15mg/mL、壳聚糖质量浓度4mg/mL、氯化钙质量浓度20mg/mL、叶绿素亚铁与海藻酸钠的质量比1:4。

[1] 向纪明, 王琳, 潘晓辉, 等. 蚕沙中叶绿酸铜钠、叶绿酸铁钠的提制及应用[J]. 安康师专学报, 1999, 11(3): 41-42.

[2] 蔡东联. 临床营养学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2007: 17.

[3] 孟庆廷. 由大蒜叶制备叶绿素亚铁钠盐及其稳定性研究[J]. 食品科技, 2010, 31(2): 271-274.

[4] 王立娟, 李坚, 叶结旺. 松针叶绿素铁钠盐的制备及稳定性研究[J].林业科技, 2004, 29(2): 43-45.

[5] 乔吉超, 胡小玲, 管萍, 等. 药用微胶囊的制备[J]. 化学进展, 2008,20(1): 171-181.

[6] KNORR D, DALY M. Mechnaics and diffusional changes observed in multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules[J]. Process Biochemistry, 1988, 23(2): 48-50.

[7] RICHARDSON S C, KOLBE H V, DUNCAN R. Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system: biocompatibility,body distribution and ability to complex and protect DNA[J]. International Journal of Pharmaceutics, 1999, 178(2): 231-243.

[8] 林咸真, 郑豪, 朱克龙. 替硝唑-壳聚糖-海藻酸钠生物复合膜的缓释性能研究[J]. 浙江大学学报: 理学版, 2006, 33(4): 444-446.

[9] 张峻, 吉伟之, 陈晓云, 等. 壳聚糖-海藻酸钠微胶囊对葡萄多酚控制释放的研究[J]. 食品科学, 2004, 25(5): 102-104.

[10] HARI P R, CHANDY T, SHARMA C P. Chitosan/Calcium-alginate beads for oral delivery of insulin[J]. J Appl Polymer Sci, 1996, 59(11):1795-1801.

[11] 何东保, 石毅, 梁红波, 等. 壳聚糖-海藻酸钠协同相互作用及其凝胶化的研究[J]. 武汉大学学报, 2002, 48(2): 193-196.

[12] POLK A, AMSDEN B, YAO K D, et a1. Controlled release of albumin from chitosan/alginate microcapsules[J]. J Pharm Sci, 1994, 83(2): 178-185.

[13] FORDTRAN J, LOCKEAR T W. Ionic constituents and osmolality of gastric and small-intestinal fluids after eating[J]. Am J Digest Disease,1966, 11(7): 503-521.

[14] 刘群, 薛伟明, 于伟婷, 等. 海藻酸钠-壳聚糖微胶囊强度的研究[J].高等学校化学学报, 2003, 23(7): 1417-1420.

[15] SEZER A D, AKBUGA J. Release characteristics of chitosan treated alginate beads: II. sustained release of a low molecular drug from chitosan treated alginate beads[J]. J Microencapsulation, 1999, 16(6): 687-696.

[16] 付颖丽, 雄鹰, 于伟婷, 等. 海藻酸钠/壳聚糖微胶囊生物相容性的研究[J]. 自然科学进展, 2002, 12(8): 845-847.

Preparation and Sustained-release Performance of Chitosan-Sodium Alginate Sodium-Sodium Ferrous Chlorophyllin Microcapsules

MENG Qing-ting，CHEN Wan-dong
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jining, Jining 273155, China)

Sodium ferrous chlorophyllin was microencapsulated into chitosan-sodium alginate micropheres for the purpose of sustained release. The microencapsulation process for sodium ferrous chlorophyllin was optimized using orthogonal array design for achieving both higher entrapment efficiency and drug loading. Meanwhile, the sustained release of the prepared microcapsules in mimic gastric and intestinal environments was observed. The optimal microcapsule formula was found to be composed of 15 mg/mL sodium alginate, 4 mg/mL chitosan and 20 mg/L CaCl2 with a core material/wall material ratio of 1:4. The microcapsules obtained using this formula displayed good sustained-release performance in both mimic environments.

chitosan-sodium alginate sodium-sodium ferrous chlorophyllin microcapsules；drug loading；entrapment efficiency；sustained release

TS201.7；TQ20

A

1002-6630(2010)20-0137-04

2010-01-08

孟庆廷(1964－)，男，副教授，本科，主要从事天然产物功效成分的研发。E-mail：mqingting@163.com