光度法测定肉制品中蛋白质含量的方法研究

尉立刚,张生万＊,齐尚忠,吴菊花,张婵娟

光度法测定肉制品中蛋白质含量的方法研究

尉立刚1,张生万1＊,齐尚忠3,吴菊花2,张婵娟2

(1.山西大学生命科学学院,山西太原030006;2.山西大学化学化工学院,山西太原030006; 3.山西省产品质量监督检验所,山西太原030012)

对含有荞麦的新型保健肉制品中蛋白质含量的测定方法进行了系统的研究,建立了一种测定肉制品中蛋白质含量的紫外分光光度法.结果表明:在选定的测定波长250 nm下,蛋白质含量在0～170μg/mL范围内其浓度与吸光度值呈良好的线性关系,其R=0.999 5、RSD=1.89%(n=7),回收率为97.24%～99.82%,该法用于实际样品测定取得了令人满意的结果.

肉制品;蛋白质;紫外分光光度法;凯氏定氮法

目前,蛋白质含量的测定方法主要有:凯氏定氮法[1-3]、电泳法[4-6]、质谱法[7]、滴定法[8]等,另外,分光光度法通常也以280 nm为测定波长[9]对蛋白质含量进行测定,这主要是利用了蛋白质分子中羰基的n-л跃迁引起的吸收,由于n-л跃迁属禁阻跃迁,故灵敏度差.目前,加有荞麦的肉制品中蛋白质含量的测定方法尚少见报道,本工作主要对含有荞麦的新型保健肉制品中蛋白质含量的测定方法进行了系统的研究,建立了一种以凯氏定氮法测定结果为标准,选择蛋白中不饱和氨基酸的л-л跃迁引起的吸收(250 nm)为测定波长,建立了光度法测定肉制品中蛋白质含量的方法.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

含有荞麦的肉制品,由本实验室自制,柠檬酸(分析纯,天津市东丽区天大化学试剂厂),UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司生产),离心机、凯氏定氮仪、滴定管.

1.2 实验方法

1.2.1 凯氏定氮法

准确称取肉制品约2.000 g,移入500 mL凯氏烧瓶中,加入硫酸铜0.2 g、硫酸钾6.0 g和浓硫酸20 mL,轻轻摇匀后进行消化反应,最后用0.100 0 mol/L HCl标准溶液进行滴定,计算出蛋白质的含量.

1.2.2 紫外分光光度法

准确称取肉制品1.000 g,用15 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液溶解,充分搅拌,然后用四层纱布过滤,在转速为3 000 r/min的离心机中离心,吸取3 mL上清液移于25 mL比色管中用蒸馏水稀释至刻度,然后用与样品溶液浓度相同的柠檬酸水溶液作空白,在250 nm处测定其吸光度,代入以凯氏定氮法为基础建立的回归方程y=0.938x+0.011,计算肉制品中蛋白质的含量.

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

准确称取肉制品0.800 g,1.300 g,2.000 g于三个烧杯中(编号1、2、3),分别用30 mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶解,过滤离心,得其上清液为供试液;以0.1 mol/L柠檬酸水溶液为空白,在230～500 nm范围内扫描(图1),从图1可知,样品在250 nm和369 nm处有两个最大吸收峰.其中,250 nm的吸收强度较大,且与蛋白浓度成正比,该峰主要是此类蛋白中不饱和氨基酸的л-л跃迁所致.所以本实验选用250 nm作为蛋白溶液的测定波长.

2.2 标准曲线绘制

准确称取一定量的含荞麦肉制品样品,按1.2.1节凯氏定氮法平行测定三次取平均值,然后按1.2.2紫外分光光度法准确称取一定量的该样品、溶解、过滤、离心,以此上清液作为蛋白标准溶液.分别吸取0.3, 1.0,2.0,3.0,4.0,6.0 mL上述蛋白标准溶液于25 mL比色管中,用蒸馏水定容至刻度.再分别吸取0.3, 1.0,2.0,3.0,4.0,6.0 mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶液于6个25 mL比色管中,用蒸馏水定容至刻度,在250 nm处测定各溶液的吸光度A.以上述凯氏定氮法为基础,计算出蛋白标准溶液中的蛋白质浓度,并将其作为横坐标,吸光度A作纵坐标,绘制标准曲线.结果表明,蛋白溶液在0～170μg/mL内线性关系良好,符合朗伯比耳定律,其线性回归方程为y=0.938x+0.011,R=0.999 5.

2.3 稳定性实验

准确称取1.000 g肉制品,加入30 mL 0.1 mol/L的柠檬酸,然后按1.2.2实验方法对样品进行处理,得样品蛋白溶液.取样品蛋白溶液3 mL置于25 mL比色管中,用蒸馏水稀释至刻度;量取3 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液置于25 mL比色管中,用蒸馏水稀释至刻度作空白,每隔10 min测定样品蛋白溶液的吸光度值A,连续测定2 h.实验表明,此期间吸光度值基本无变化,稳定性良好(见图2).

图1 紫外吸收光谱图Fig.1 Graph of ultraviolet spectrum

图2 稳定性实验Fig.2 Result of stability test

2.4 回收率实验

准确称取肉制品1.000 g,加入30 mL 0.1 mol/L的柠檬酸,按1.2.2实验方法对样品进行处理得样品蛋白溶液.取该溶液1、2、3 mL分别置于3个25 mL比色管中,然后分别加入4 mL标准蛋白溶液于上述比色管,用蒸馏水稀释至刻度,以对应浓度的柠檬酸作空白,测定其吸光度值A,计算回收率(见表1).

表1 回收率实验Table 1 Experiment of recovery

由表1可知,本方法回收率较好,可用于荞麦火腿肠中蛋白质含量的定量测定.

2.5 精密度实验

准确称取肉制品2.000 g,加入60 mL 0.1 mol/L的柠檬酸,按1.2.2实验方法对样品进行处理,得样品蛋白溶液.分别准确量取10份样品蛋白溶液3 mL于25 mL比色管中用蒸馏水稀释至刻度,以对应浓度的柠檬酸作空白,按照1.2.2中的测定方法测定它们的吸光度值A.结果为0.828,0.827,0.827,0.828, 0.829,0.828,0.828,0.828,0.828,0.828.相对标准偏差为0.00 036.

2.6 样品测定

对生产日期不同的三批荞麦火腿肠样品,分别称取1.065 2 g、1.112 9 g、1.096 3 g,按照1.2.2中样品测定方法分别对其进行测定,结果见表2.

表2 样品测定Table 2 Determination of sample

由表2可知该方法的测定结果与凯式定氮法的测定结果基本符合.

3 结论

荞麦是我国北方特有的一种农作物,含有丰富的营养成分.含荞麦的肉制品中蛋白质含量准确测定方法的建立,对荞麦肉制品生产工艺的控制和产品质量保证具有极为重要的意义.由于蛋白质含有肽键和其降解产物芳香环残基(如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等)中含有的共轭双键在紫外区对一定波长的光有选择吸收,并且其吸光度在一定范围与蛋白质浓度成正比,因此该实验选择紫外光度法,250 nm为测定波长,结果表明该方法准确、灵敏度高、精密度好、操作简便.

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Assaying Protein in Meat Product by a Spectrophotometry

WEI Li-gang1,ZHANG Sheng-wan1,QI Shang-zhong3,WU Ju-hua2,ZHANG Chan-juan2
(1.School of Lif e Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China; 2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi University,Taiyuan030006,China; 3.S hanxi Product Quality Supervision and Inspection Institute,Taiyuan030012,China)

A determination method to the protein in the buckwheat meat product was introduced.UV spectrophotometry was applied to assay the protein in the buckwheat meat product.The results indicated:in the designation determination wavelength 250 nm,the protein was 0～170μg/mL,the consistency and the difference of absorbency were linear.The correlation coefficientR=0.999 5,theRSDwas 1.89%,the recovery rate was 97.24%～99.82%,the method was reliable in the determination of sample.

meat products;protein;UV Spectrophotometry;kjeldahl nitrogen determination method

O657.32;TS207

A

0253-2395(2010)02-0267-03

2009-09-16;

2009-12-03

山西省攻关项目(20080311082)

尉立刚(1983-),男,山西襄汾人,硕士研究生,主要从事食品化学研究.＊通讯联系人:E-mail:zswan@sxu. edu.cn