重水环境下的氧化大豆蛋白傅里叶变换红外(FT-IR)分析

黄友如华欲飞张根华费 薇闵 娴

(常熟理工学院生物与食品工程学院1,常熟 215500)

(江南大学食品学院2,无锡 214036)

重水环境下的氧化大豆蛋白傅里叶变换红外(FT-IR)分析

黄友如1华欲飞2张根华1费 薇1闵 娴1

(常熟理工学院生物与食品工程学院1,常熟 215500)

(江南大学食品学院2,无锡 214036)

应用傅里叶变换红外研究了不同亚油酸浓度下脂肪氧合酶催化诱导产生的大豆蛋白聚集体的结构变化。结果表明,由LOX催化LA氧化诱导的大豆蛋白质聚集,反映在红外光谱中,具有两个较为明显的特征,一是 1 610 cm-1(RSP4和 RSP5)或 1 615 cm-1(RSP2和 RSP3)附近谱峰分量的出现,二是酰胺 I′各谱峰分量向低波数方向位移。此结论是在对反应体系中LA浓度在 3.14×10-3～7.51×10-3mol/L范围之间的反应样品研究后得出的,说明反应体系中LA浓度不同,蛋白质分子间相互作用的强度不同;由于分子间β-折叠的形成与蛋白质分子间较强的相互作用有关,这些特征谱峰的出现反映了因氧化性修饰而发生聚集的蛋白质分子之间氢键作用的加强。

大豆蛋白 脂肪氧合酶 亚油酸 氧化性修饰 FT-I R

通过建立由脂肪氧合酶 (lipoxygenase,LOX)、亚油酸 (linoleic acid,LA)和低脂质含量大豆蛋白(lipid-reduced soy proteins,LRSP)组成的三元模拟体系,分析研究了脂肪氧合酶催化亚油酸氧化诱导的大豆蛋白氧化性修饰机理[1],结合电子顺磁共振波谱(EPR)研究了模拟体系中导致氧化性大豆蛋白聚集体形成的自由基由氧化亚油酸到大豆蛋白的迁移并确定了部分自由基的类型[2-3]。事实上,大豆蛋白聚集体的形成与蛋白质本身结构的变化有着密切的关系。研究清楚大豆蛋白结构的变化,对进一步阐明大豆蛋白质聚集体形成的分子机理,具有重要的意义。表征蛋白质结构变化的方法很多,其中傅里叶变换红外 (FT-IR)、激光拉曼 (La2 ser Raman)光谱和圆二色性光谱 (CD)是进行这些研究的强有力工具,借助这些现代化测试仪器,可探讨蛋白质在经过生物、物理和化学的方法处理后构象和构型的变化。

蛋白质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密切相关,FT-IR光谱技术是研究氢键的强有力手段[4]。蛋白质在红外区有若干特征吸收带,酰胺 I带 (1 600～1 700 cm-1)对于研究二级结构最有价值。与酰胺谱带构象敏感性有关的因素包括氢键和迁移偶极子间的偶联,偶极子间的偶联使酰胺 I谱带分裂,分裂的多少取决于相互作用的偶极子取向及距离,从而提供多肽链中肽单位的几何空间排列信息。

应用傅里叶变换红外波谱对大豆蛋白聚集体在不同状态下的微区结构和二级结构进行测定分析,研究不同LA浓度下LOX诱导聚集过程中蛋白质构象的变化,进一步揭示大豆蛋白质聚集体形成的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

低温脱脂豆粕:山东禹王实业有限公司植物油厂;脂肪氧合酶 (LOX I-B,70 800单位/mg)、亚油酸(色谱纯,含量≥99.0%):Sigma公司;重水 (含重氢:99.8%,pD 6.8):北京化工厂;其他试剂均为分析纯;FT-I R光谱仪:NicoletNexus 470 FT-I R spec2 trometer,Thermo Electron Corparation,USA。

1.2 低脂质含量大豆蛋白的制备

[1-2]。

1.3 用于结构分析的样品制备

底物LA溶液和LOX酶液的配制见参考文献[1 -2]。将 LRSP溶于去离子水中配制成 5%的大豆蛋白溶液,用 1.0 mol/L NaOH调至 pH 9.0。

模拟反应体系由LOX、LA和LRSP组成(表 1),将其反应体系放入 30℃的水浴中分别恒温振荡培养 6.0 h后取出,冰浴冷却至 0℃后用 1.0 mol/L HCl调 pH值至 4.5酸沉,离心 (5 000×g,30 min)取沉淀水洗,水洗后的蛋白沉淀分散于去离子水中并用1.0 mol/L NaOH调至pH 7.0。所得蛋白(Reacted soybean proteins,RSP)溶液分别冷冻干燥后粉碎并过80目标准筛。

表 1 模拟反应体系的组成

1.4 FT-IR光谱测定

样品处理:将蛋白样品分散在重水中配制成 10 mg/mL的溶液,分析前在 5℃下贮藏 48 h,以使 H/D能够完全置换。利用 FT-IR光谱仪,采用表面衰减全反射采样器 (ATR),在对光谱进行水汽和二氧化碳校正后,以D2O为背景扫描,在与样品测定完全相同的环境下,室温下敞开状态收集 D2O谱图作为D2O校正的参考光谱,使用仪器自备软件 OMN IC数据处理软件自动进行 D2O校正;再将样品溶液均匀地铺满ATR采样器附件的 ZnSe晶片上,在相同条件下进行扫描收集样品光谱,扫描范围 650～4 000 cm-1,扫描 256次,分辨率 4 cm-1。

红外光谱数据处理利用仪器自备软件 OMN IC E.S.P.对所得红外光谱的酰胺各带进行傅里叶去卷积处理[5-6],控制半峰宽 (FWHM)为 (18 ±0.3) cm-1,增强因子 (Enhancement factor)为 2.0。结合原始谱图和去卷积谱得到的子峰峰位,进行相应二级结构构象指认。

2 结果与分析

2.1 豆蛋白酰胺 I′红外频率范围及其对应的二级结构指认

图 1为在不同 LA浓度下反应产生聚集的大豆蛋白重水溶液的原始红外图谱。其中酰胺 I带(1 600～1 700 cm-1,图 1b)对于结构分析最重要,这个带 80%是来自于 C=O键上的伸缩振动,同时也和C=O旁的 C-N伸缩和 N-H弯折振动有关,它对肽和蛋白质的二级结构的变化非常敏感[7]。在RSP1样品的原始红外光谱中,酰胺 I带呈现为一个宽峰,最大吸收波长在 1 637 cm-1。实际上酰胺 I带是由蛋白质不同二级结构的谱峰分量叠加形成的[8-9]。

图 1 溶于重水溶液大豆蛋白的原始红外图谱

图 2 溶于重水溶液的大豆蛋白酰胺 I′的傅里叶红外去卷积谱

图 2a为溶于重水溶液的大豆蛋白酰胺 I′的傅里叶去卷积谱。其不同谱峰分量对应为大豆蛋白各结构部分的振动,这些区带是与特异的二级结构相对应的。在蛋白质浓度为 10 mg/mL时,大豆蛋白的酰胺 I′主要有以下几个特征性谱峰,即 1 695 cm-1(β-折叠),1 684 cm-1(β-折叠或转角),1 670 cm-1(β-转角),1 661 cm-1(β-转角),1 649 cm-1(无规卷曲 +α-螺旋),1 637和 1 615 cm-1(β-折叠),以及 1 605 cm-1附近归属于侧链残基的一个肩峰(表 2)[10-17]。从图 2可以看出,反应后大豆蛋白的酰胺 I′已发生了很大的变动。关于 1 670～1 695 cm-1区域带的归属问题,目前尚存争议,有人将其归属于β-转角,也有人认为应将其归属于反平行β-折叠结构[18]。因此,高频组分 1 684和 1 678 cm-1谱峰应引起特别的注意。这两个谱峰分量可归属于β -转角(可能是交联在一起的β-折叠股,也就是β -折叠结构本身的一部分),也可归属于反平行β-折叠结构。在含有反平行β-折叠结构的蛋白质中,高频β-折叠组分通常比β-折叠主要组分高 50～70 cm-1[19]。

在样品 RSP2和 RSP3中,当反应体系中的 LA浓度从 3.14 mmol/L升高到 4.63 mmol/L时,位于1 695 cm-1附近的谱峰强度增加很快。与此同时,除了 RSP3样品位于 1 615 cm-1附近的谱峰强度保持不变外,位于 1 684,1 670,1 649,1 637和 1 605 cm-1附近的其他谱峰的强度均明显降低。位于1 615 cm-1附近的谱峰为分子间β-折叠结构的特征组分,是由于蛋白质分子聚集而产生的[20-21],说明反应后 RSP3样品的聚集程度明显,蛋白分子间β -折叠结构增加。此外,在样品 RSP3中,在 1 615～1 637 cm-1范围出现了一个单个谱峰 (1 623 cm-1),且 1 691 cm-1谱峰位移至 1 689 cm-1。在前面的分析中已经证实,在与 LOX催化产生的LA氧化产物反应后,样品 RSP2和 RSP3业已形成聚集体[1]。尤其是 RSP3样品,其聚集程度随着LA浓度增加而明显增强。这里的红外结果表明,没有发生聚集的大豆蛋白的红外光谱在 1 610～1 637 cm-1范围仅出现一个谱峰,而发生聚集的大豆蛋白在此范围内则出现两个谱峰。在其它蛋白质的红外光谱中也观察到1 623 cm-1附近的谱峰[22],通常将它归属于强烈键合或扭曲的β-折叠股(β-strand)结构。也就是说,这些谱带可能产生于一些短的肽段,这些肽段是一种伸展结构,但并未形成一般意义上的β-结构。我们的解释与此结论相一致,即 1 623 cm-1附近谱峰的产生是由于大豆蛋白在聚集体形成过程中而产生的强烈键合β-折叠股结构引起的。正如前面分析的那样,由LOX催化LA氧化诱导产生的聚集伴随着蛋白质构象的转变[1]。随着反应体系 LA浓度的增加,反应后大豆蛋白红外光谱的差异说明其蛋白质构象业已发生转变。

β-折叠是由于局部的协同性氢键形成产生,在球状蛋白质中,氢键既可以在不同肽链或不同分子之间形成,也可以在同一肽链的不同肽段(β-strand)之间形成。反应后大豆蛋白红外光谱1 610～1 637 cm-1范围的变化,反映了氢键在大豆蛋白聚集体形成过程中发挥着重要的作用。

表 2 溶于重水溶液的大豆蛋白酰胺 I,II,III红外频率范围及其对应的二级结构指认

在 RSP4和 RSP5样品中,上述所提及的所有谱峰均向较低波数方向位移。位于 1 691和 1 678 cm-1附近谱峰强度明显增加,相反位于 1 641和1 630 cm-1附近谱峰强度则降低了。但样品 RSP5位于 1 660 cm-1附近谱峰强度保持不变。这表明反应后样品的β-折叠和转角结构增加,α-螺旋或无规卷曲结构降低了。如前所述,包括疏水效应,氢键和静电相互作用在内的物理相互作用在蛋白质聚集过程中,扮演着非常重要的角色。RSP4和 RSP5样品各谱峰分量发生位移说明反应后的大豆蛋白结构已发生改变,在随后的聚集体形成过程中蛋白质的构象进行了重排。随着反应体系LA浓度的增加,位于1 691和 1 678 cm-1附近谱峰强度的增加同时也表明此类蛋白质聚集程度增强。

位于 1 684和 1 623 cm-1附近的两个组分峰,一般与聚集蛋白质分子间反平行β-折叠结构的形成有关[23]。由此看来,在 LOX催化的高浓度 LA反应体系中的大豆蛋白似乎解折叠并发生聚集。这些数据与前面的研究结论相一致,即在高浓度LA反应体系中的大豆蛋白易于发生变性[1]。

2.2 大豆蛋白酰胺 II′红外频率范围及其对应的二级结构指认

图 3为溶于重水溶液的大豆蛋白酰胺Ⅱ′的傅里叶去卷积谱。从图 3中可以看出,α-螺旋位于1 520 cm-1附近,谱峰强度较弱;而位于 1 543、1 559 cm-1附近分别代表β-折叠、α-螺旋/无规卷曲结构的谱峰均十分清晰。与对照样品相比,样品酰胺II′也有明显的变化,主要表现在各特征谱峰向低波数方向位移且强度减弱。特别是 RSP4和 RSP5样品各谱峰分量位移的幅度较大(可达 6～9 cm-1),各谱峰峰形也出现明显差异;如位于 1 520 cm-1附近的α-螺旋谱峰,已位移至 1 513 cm-1且峰形尖锐;位于 1 543 cm-1附近代表β-折叠谱峰位移至 1 530 cm-1且峰形变宽;位于 1 572 cm-1附近代表β-折叠的谱峰位移至 1 564 cm-1,且峰形由对照样品的肩峰凸显为一个明显的吸收峰。RSP4和 RSP5样品各谱峰分量的变化,反映了反应后的蛋白质构象已发生了明显的变化,表现为β-折叠结构的相对增加,α-螺旋和无规卷曲等结构的相对减少。RSP2和 RSP3样品也出现类似的情况,即β-折叠结构相对增加, α-螺旋/无规卷曲等结构相对减少。

图 3 溶于重水溶液的大豆蛋白酰胺Ⅱ′的傅里叶红外去卷积谱

2.3 大豆蛋白酰胺ⅢI′红外频率范围及其对应的二级结构指认

图 4为溶于重水溶液的大豆蛋白酰胺Ⅲ′的傅里叶去卷积谱。相比之下,大豆蛋白红外光谱的酰胺Ⅲ′较弱,没有酰胺Ⅰ′那么显著。但在酰胺Ⅲ′中位于 1 236 cm-1附近代表β-折叠的谱峰分量较为清晰,与对照样品相比,RSP2和 RSP3样品在该区域谱峰向低波数方向位移且强度增加,说明反应后样品的β-折叠结构有所增加。位于 1 261、1 250 cm-1附近代表无规卷曲结构的谱峰变宽甚至形成微小的肩峰。而位于 1 286～1 317 cm-1之间代表α-螺旋的谱峰最弱,它在反应后的样品中形成微小的肩峰乃至消失。RSP4和 RSP5样品也有类似的变化,不同的是各谱峰分量向低波数方向位移的数值增加,差值可达 5～9 cm-1。

图 4 溶于重水溶液大豆蛋白酰胺Ⅲ′的傅里叶红外去卷积谱

综合酰胺各带的变化,可以得出,由LOX催化LA氧化诱导的大豆蛋白质聚集,反映在红外光谱中,具有两个较为明显的特征,一是 1 610 cm-1(RSP4和RSP5)或 1 615 cm-1(RSP2和 RSP3)附近谱峰分量的出现,二是酰胺Ⅰ′各谱峰分量向低波数方向位移。上述结论是在对反应体系中LA浓度在 3.14×10-3～7. 51×10-3mol/L范围之间的反应样品研究后得出的,说明反应体系中LA浓度不同,蛋白质分子间相互作用的强度不同;由于分子间β-折叠的形成与蛋白质分子间较强的相互作用有关,这些特征谱峰的出现反映了聚集蛋白质之间氢键作用的加强。

3 结论

应用 FTI R研究了不同亚油酸浓度下脂肪氧合酶催化诱导产生的大豆蛋白聚集体的构象变化。该技术提供了大豆蛋白分子结构的详细信息,使得对大豆蛋白聚集体的形成有了新的理解。结果表明,当大豆蛋白与脂肪氧合酶催化的亚油酸反应时,通过氢键形成的分子间β-折叠结构在蛋白质 -蛋白质相互作用和聚集体形成中发挥着重要的作用。通过β-折叠谱带频率的变化与大豆蛋白不同聚集程度的比较研究,揭示了聚集蛋白质的构象变化与大豆蛋白的聚集程度密切相关。大豆蛋白的聚集程度不仅受亚油酸浓度的影响,而且也与反应后蛋白质的分子定向有关。

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FT-IR SpectroscopyAnalysis ofOxidative Soybean Proteins in D2O

Huang Youru1Hua Yufei2Zhang Genhua1FeiWei1Min Xian1

(School ofBiological Science and Food Engineering,Changshu Institute of Technology1,Changshu 215500)
(School of Food Science and Engineering,Jiangnan University2,Wuxi 214036)

The molecular structure of soybean protein aggregates for med at different linoleic acid concentration catalyzed by lipoxygenasewere examined by FT-IR.Results:The linoleic acid-induced aggregation of soybean pro2 teins is characterized by the appearance of a component located near 1 610 cm-1in samples RSP4 and RSP5,or near 1 615 cm-1in samples RSP2 and RSP3,and by another fact that all of the amide I′components shift to lowerwave numbers in the samples.Thisobservation ismade at the linoleic acid concentrations bet ween 3.14×10-3and 7.51× 10-3mol/L,suggesting that the intensity of the intermolecular interactions are different in the samples.Since the for2 mation of intermolecularβ-sheets seems to be involved in stronger interactions bet ween proteins,the appearance of the characteristic components is a result of strengthening of H-bonds between aggregated proteinsmodified by linole2 ic acid oxidation.

soybean protein,lipoxygenase,linoleic acid,oxidative modification,FT-IR

TS201.2+1;TQ645.9+9 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)05-0019-06

国家自然科学基金(20476040)

2009-05-27

黄友如,男,1966年出生,副教授,博士,粮食、油脂及植物蛋白工程