纤维素酶对山葡萄渣中白藜芦醇提取的影响＊

钱时权,石亚中,伍亚华,马龙,张斌,赵大庆,陶志杰,谢海伟,孙兰萍,许晖

葡萄中含有丰富的白藜芦醇,葡萄皮和葡萄籽中最多。研究发现,白藜芦醇具有抗癌、保护心血管、抗氧化、抗自由基、抗突变、抗菌消炎、辐射防护等多方面的作用,深受生物医学界的重视[1]。白藜芦醇生物提取的方法主要有有机溶剂法、热水浸提法、超声波法、超临界萃取法、酶法等[2-7]。其中,酶法提取中应用较多的是纤维素酶,大部分植物的细胞壁是由纤维素构成的,植物的有效成分往往包裹在细胞壁内,纤维素酶是一组复合酶,能够水解纤维,使植物细胞壁破坏,充分释放细胞内含物,有利于对有效成分的提取,进而提高物料的利用率[2-4]。目前,采用纤维素酶解提取白藜芦醇的研究已在虎杖中得到很好的研究[7]。本实验优化了酶解条件,以获得从山葡萄渣中提取白藜芦醇的最佳酶解工艺参数,为山葡萄中白藜芦醇的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山葡萄渣粉末:将山葡萄皮、籽混合物阴干,粉碎过 60目筛备用;白藜芦醇标准品,纯度 98%,购自山东泓捷生物科技有限公司;纤维素酶,河南省所以化工有限公司;无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯,均为分析纯。

紫外分光光度计 752型,波长范围 200～1 000 nm,上海光学仪器厂;旋转蒸发仪,上海予华仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇的提取

用清水洗净山葡萄渣,晒干后粉碎,过 60目筛备用。取粉末 5 g,放入 150 mL锥形瓶中,加入适量水和纤维素酶进行酶解,酶解后加入一定量的 70%乙醇,提取一段时间后,将提取液离心,经浓缩、蒸发得白藜芦醇样品。

1.2.2 白藜芦醇含量的测定[8]

1.2.2.1 白藜芦醇标准曲线的制作

称取适量白藜芦醇置于容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,得白藜芦醇对照品储备液。精密吸取对照品储备液,配制成一系列不同浓度的标准溶液,于306 nm处测定吸光度值,绘制标准曲线,以对照品浓度 (μg/mL)为横坐标,以吸光度为纵坐标,得回归线性方程y=0.694 2x-0.031 5(R2=0.994 2),线性范围为 0.3～1.59μg/mL。从线性回归方程看出,白藜芦醇含量与吸光度值成正相关。

1.2.2.2 样品中白藜芦醇含量的测定

准确称取一定量以上提取方法 (方法 1.2.1)得到的样品于 50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为样品液,于 306 nm处测定吸光度值,由回归线性方程得出白藜芦醇含量。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 酶浓度对白藜芦醇提取效果的影响

取适量粉末,分别添加酶浓度为 0.5 mg/g、1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g、2.5 mg/g、3.0 mg/g的纤维素酶,在 55℃,pH值 5条件下,酶解 1.5 h。酶解后加入一定量的乙醇,提取一段时间后,将提取液离心,经浓缩、蒸发得白藜芦醇样品。用甲醇溶解样品并稀释,摇匀,于 306 nm处测定吸光度值,由回归线性方程得出白藜芦醇含量。考察酶浓度对酶解液中白藜芦醇含量的影响,

1.2.3.2 酶解 pH值对白藜芦醇提取效果的影响

在酶浓度 1.5 mg/g,55℃,pH值 5条件下,pH值3.5～6.0范围,酶解 1.5h。后续操作同 1.2.3.1。考察 pH值对酶解液中白藜芦醇含量的影响,

1.2.3.3 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响

在酶浓度 1.5 mg/g,pH值 5条件下,40～65℃酶解 1.5 h。后续操作同 1.2.3.1。

1.2.3.4 酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响

在酶浓度 1.5 mg/g,55℃,pH值 5条件下,酶解 0.5～3 h。后续操作同 1.2.3.1。

1.2.4 正交实验

在单因素试验的基础上对影响白藜芦醇提取率的因素:酶浓度、酶解 pH值、酶解温度和酶解时间进行L9(34)正交试验。根据正交试验结果分析得出山葡萄渣白藜芦醇提取的最佳酶解条件。

2 结果与讨论

2.1 单因素对白藜芦醇提取率的影响

2.1.1 酶浓度对白藜芦醇提取效果的影响

由图1可知,随着酶浓度的增加,白藜芦醇含量逐渐增大,但继续增加酶浓度,反而有下降的趋势。本实验中酶浓度为 1.5 mg/g时,白藜芦醇的含量最大。

图1 酶浓度对白藜芦醇提取效果的影响

2.1.2 酶解 pH值对白藜芦醇提取效果的影响

结果如图2所示。从图2可以看出,随着 pH值的增大,白藜芦醇的含量先增加,至 pH值 5时,白藜芦醇含量达到最大,这可能与纤维素酶在 pH值 5时活性最强有关,而后白藜芦醇含量又逐渐减小,原因可能是由于 pH值的增加导致纤维素酶构象发生改变,使酶活性降低,也有可能改变底物解离状态,影响酶与底物的结合。因此确定酶解较佳 pH值为 5。

2.1.3 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响

结果如图3所示。由图3看出,酶解温度在55℃时白藜芦醇的含量最高,但在 55℃以后,温度升高,含量增加不明显。选择酶解温度为 55℃。

图2 pH值对白藜芦醇提取效果的影响

图3 温度对白藜芦醇提取效果的影响

2.1.4 酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响

结果如图4所示。由图4可知,反应开始时,随着酶解时间的延长,白藜芦醇的含量逐渐增大,酶解1.5 h后,再延长酶解时间,白藜芦醇含量逐渐减小,原因是由于随着反应时间的延长,酶反应速率下降,酶解产物白藜芦醇的增加加速了逆反应的进行。酶与底物的结合需要一定的时间,时间过短酶与底物结合效率比较低,酶解效果不理想,当酶与底物充分结合后,再延长时间,提取效率会下降。因此,确定较适宜酶解时间为 1.5 h。

图4 酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响

2.2 正交试验

根据单因素实验结果,考虑到实际操作,选取酶浓度 (A)、pH值 (B)、酶解温度 (C)、酶解时间 (D)4因素进行L9(34)正交实验。山葡萄渣白藜芦醇提取酶解条件的试验方案和正交实验结果如表1、表2和表3所示。

表1 白藜芦醇提取工艺因素与水平表

表2 正交实验结果

通过直观分析可知,影响因素的大小顺序为 C＞A＞D＞B,即酶解温度 ＞酶浓度 ＞酶解时间 ＞酶解pH。综合以上因素和实验结果,确定最佳酶解条件为 A2B3C2D2,即酶浓度 1.5 mg/g,酶解 pH 5.5,酶解温度 55℃,酶解时间 1.5 h。

表3 方差分析表

2.3 工艺条件验证

在优化的纤维素酶酶解条件下,进行 5次重复验证试验,得到山葡萄渣中白藜芦醇的平均含量为0.680 mg/g(RSD为 0.701%),与未经酶解利用有机溶剂提取山葡萄渣中白藜芦醇的平均含量为 0.314 mg/g(RSD为 0.843%)相比,提高了 2.17倍,由此可以推断,纤维素酶能有效提高山葡萄渣中白藜芦醇提取效率。

3 结论

纤维素酶能有效提高山葡萄渣白藜芦醇提取效率。通过单因素实验和正交实验,得到山葡萄渣白藜芦醇提取的最佳酶解条件为:酶浓度 1.5 mg/g,pH值 5.5,温度 55℃,酶解时间 1.5 h。在此条件下,白藜芦醇的含量为 0.680 mg/g。

[1] 刘芸,仇学农,苏肖洁.固态发酵对葡萄皮渣中白藜芦醇含量的影响 [J].食品与发酵工业,2010,36(9):85-89.

[2] 李婷,李胜,张青松等.酶法提取葡萄皮渣中自藜芦醇工艺研究[J].食品科学,2008,29(12):194-197.

[3] Langcake P,Pryce R.The production of resveratrol byV itis viniferaand othermembers of the vitaccae as a response to infection or injury[J].Physio Plant Path,1976,9(11):77-86.

[4] Jeandet P,Bessis R,Maume B F,et a1.Effect of enological practices on the resveratrol isomer content of wine[J].J Agric Food Chem,1995,43(2):316-3l9.

[5] 张干伟,孙素玲,汤坚.花生根中白藜芦醇的醇提工艺及清除自由基研究[J].食品科技,2008(2):153-155.

[6] 李胜华,伍贤进.超声波法提取虎杖中白藜芦醇的优化工艺研究[J].食品工业科技,2008,29(7):162-164.

[7] 李梦青,聂媛,张洁等.酶解法提取虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素 [J].精细化工,2008,25(5):467-470.

[8] 郑湘娟,余淑娴,徐晓芳,等.紫外分光光度法测定虎杖中自藜芦醇的含量[J].时珍国医国药,2008,19(8):1 881-1 882.