液相色谱串联质谱法测定动物源性食品中硝呋烯腙的残留量*

蒋树

(国家农副加工食品质量监督检验中心，安徽国家农业标准化与监测中心，合肥 230051)

近20年来，兽药(包括饲料药物添加剂)在畜牧业中的应用日益广泛，而动物性食品中的兽药残留问题也逐渐成为人们关注的社会焦点。目前非法使用违禁药物、滥用抗菌药和药物添加剂等是造成我国动物源性食品中兽药残留超标，引起畜禽产品消费安全和食品贸易争端的主要原因。据统计，大约有70%～80%的食品动物，在其一生中或多或少服用过药物[1]。随着人们对食品与环境质量要求的不断提高，饲料中抗生素的添加所引起的问题愈来愈引起人们的关注。

硝呋烯腙(Nitrovin)是一种抗生素，能够促进动物生长,它通过增加动物肠道粘膜的通透性，从而能有效地提高营养物质在动物消化道中的消化和吸收；硝呋烯腙还能有效抑制动物消化道内病原微生物对葡萄糖的利用，使其新陈代谢过程受阻，从而抑制和杀灭多种瘸原微生物，减少动物感染疾病的机会，提高抗病能力[2]，因此硝呋烯腙在畜禽养殖方面有一定的应用[3-6]。由于硝呋烯腙对人体会造成潜在的危害，所以我国农业部235号公告中将其作为违禁药物，在所有动物源性食品中不得检出。

目前，有关动物源性食品中硝呋烯腙残留量测定方法的研究只有少量文献报道[7,8]，国家也尚未制定相关检测标准，因此建立动物源性食品硝呋烯腙残留量的快速、灵敏的检测方法尤为重要。为此笔者对液相色谱串联质谱法测定动物源性食品中硝呋烯腙的残留量进行了研究，这既可以为执法监管机构提供技术支持，又可以为相关标准的制定提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪：6410 Triple Quad LC/MS型，美国安捷伦公司；

去离子水发生器：Milli-Q型，美国Millipore公司；

硝呋烯腙标准品：德国Dr.公司；

乙腈、乙酸、甲酸 ：色谱纯，美国TEDIA公司；

有机微孔过滤膜：孔径0.22 μm；

硝呋烯腙标准储备液：100 mg/L，准确称取10.0 mg硝呋烯腙标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，使用时根据需要用流动相稀释成合适标准工作溶液，现用现配；

实验用水为Milli-Q去离子高纯水。

1.2 仪器分析条件

(1)液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18卡套柱( 30 mm×2.1 mm，1.8 μm)或相当者；柱温：35℃；流速：0.20 mL/min；进样量：10 μL；流动相：0.05%甲酸-甲醇(体积比1∶1)，等度洗脱。

(2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI+)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：11 L/min；雾化器压力：276 kPa(40 psi)；毛细管电压：3 500 V；硝呋烯腙最佳的碰撞电压、碰撞能量以及相应的定性离子对和定量离子对见表1。

表 1 多反应监测(MRM)条件

1.3 样品处理方法

称取5.0 g(精确到0.01 g)试样于50 mL聚丙

烯离心管中，加入25.0 mL提取液，匀浆1 min，漩涡混匀1 min，超声提取10 min，以10 000 r/min离心5 min(温度5℃)，取上清液。重复提取一次，合并两次上清液。合并的上清液于45℃下旋转蒸发至近干，用3 mL水溶液(含2%二甲基甲酰胺+1%甲醇)溶解后作为待净化液。将待净化液以不超过1 mL/min的速度过Agilent SampliQ OPT固相萃取柱(50 mg， 3 mL，使用前分别用6 mL甲醇和6 mL水活化)，弃去滤液。用3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用5 mL甲醇溶液(含5%二甲基甲酰胺)洗脱并收集洗脱液。将洗脱液于45℃下用氮气吹干，用1 mL流动相定容，漩涡混匀后过0.22 μm滤膜，然后用液相色谱-串联质谱法进行测定。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

考察了硝呋烯腙在3种不同类型的色谱柱Agilent Eclipse XDB C18( 150 mm× 4. 6 mm，5.0 μm)、ZORBAX Extend-C18( 100 mm× 2.1 mm，3.5 μm)和ZORBAX SB-C18卡套柱( 30 mm×2.1 mm，1.8 μm)上的保留时间、峰型及响应。同时考察了2.0、5.0、10.0 mmol/L乙酸铵-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇等流动相体系和流速。Eclipse XDB C18分析柱由于柱内径及填料粒径大，不适用于质谱系统低流速进样分析，且出峰时间偏长，峰宽过大。ZORBAX Extend-C18适用于较宽的pH值范围，尤其适用于碱性pH值范围的目标物的分析。最终选用了0.1%甲酸-甲醇流动相体系，和 ZORBAX SB-C18卡套柱(30 mm×2.1 mm，1.8 μm)。ZORBAX SB-C18卡套柱较适合在偏酸性条件下工作，该色谱柱1.8 μm填料，柱长仅为30 mm，分析速度快，硝呋烯腙的保留时间在0.8 min左右，包括进样时间和平衡色谱柱时间在内每个样品分析耗时仅需3.0 min。该方法与普通的HPLC/MS/MS方法相比，可大大节省分析时间，且与串联质谱完美连接，不存在分流问题。

硝呋烯腙化合物中含有N元素，通过比较，它在正离子模下响应更好。在流动相中加入甲酸能增加硝呋烯腙在正离子(ESI+)模式下的离子化效率。因此分别在流动相中加入0.05%甲酸或5 mmol/L乙酸铵，结果发现在加入甲酸后，硝呋烯腙标准溶液峰形和响应均优于乙酸铵。甲酸浓度为0.05%时，响应值最高。比较甲酸-甲醇体系与甲酸-乙腈体系时，发现甲酸-甲醇体系出峰时间略晚于甲酸-乙腈体系，但在灵敏度方面与甲酸-乙腈体系无显著性差异。考虑到流动相的经济性和环保性，实验最终选用了毒性较低且价格便宜的甲酸-甲醇体系。当0.05%甲酸与甲醇的体积比为50∶50时，峰形和响应值均较好。

2.2 质谱条件的选择

参照CAC和EU第657/2002 /EEC号决议中有关规定[9]，选择两对离子进行MRM监测，其中母离子和子离子要按照每种化合物的质谱图和结构特性选取，并且在实际样品分析中基质干扰较少。

液相色谱以0.2 mL/min的流速，将10 mg/L的标准溶液引入离子源，分别在正负离子模式下进行工作，发现该化合物适合正离子模式。这是由于该化合物中含有N原子，更易于结合H+。图1为硝呋烯腙的一级全扫描质谱图，利用一级质谱全扫描分析目标化合物的分子离子峰，选取m/z361.2为母离子,再以10 mg/L硝呋烯腙标准溶液对质谱参数进一步优化，以获得最佳的质谱条件。分别在90、100、110、120 V的碰撞电压下对硝呋烯腙的母离子进行选择性监测，比较不同碰撞电压下母离子的强度，确定硝呋烯腙的最佳解离电压为110 V。然后在110 V的碰撞电压下，比较不同碰撞能量对子离子的影响，最终确定m/z222.1和m/z58.0为定量及定性离子，优化后的多反应监测条件见表1。

图1 硝呋烯腙的一级全扫描质谱图

2.3 提取溶剂及净化柱的选择

分别使用Agilent SampliQ OPT聚合物固相萃取小柱(SPE)和VARIAN BOND ELUT PLEXA PCX固相萃取小柱，结果发现PCX SPE柱对目标物硝呋烯腙的保留效果不好，直接影响了最终的回收率。SampliQ OPT SPE对样品进行净化，可有效去除杂质，方法检出限较低，适合动物源性食品中硝呋烯腙提取液的净化且成本较低。

研究了乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、ACN-DMF、ACN-DMF-2%氨水对硝呋烯腙的提取效果。结果发现，ACN-DMF-2%氨水混合体系提取效果明显优于其它3种提取液，最终选择此混合体系作为提取溶液。考察了DMF在体系中体积比的变化对回收率的影响，结果见图2。从图2可以看出，当DMF在体系中的体积分数约为40%时，回收率最高，这是由于硝呋烯腙在DMF中有更好的溶解度。

图2 DMF含量对回收率的影响

氨水含量对回收率的影响见图3。由于硝呋烯腙可能在动物组织中与蛋白质等物质结合紧密，不易于提取，而随着氨水的加入，体系pH值升高，削弱了硝呋烯腙与组织间的结合力，提取效果增强，提高了回收率。通过比较，最终选择2%的氨水进行萃取。

图3 氨水的含量对回收率的影响

取标准溶液过固相柱，分别用纯水以及5%、10%、15%的甲醇水溶液作为淋洗液。结果发现，在纯水和5%甲醇水溶液中未发现硝呋烯腙;而10%和15%甲醇水溶液中有少量硝呋烯腙损失，且随着甲醇含量的增加，硝呋烯腙的损失增加。这说明硝呋烯腙的极性可能与甲醇相似，当甲醇的含量为10%时，硝呋烯腙能溶于其中而随其流失。纯水洗涤能力低于5%甲醇水溶液，不能洗去部分杂质，因此选用5%甲醇水溶液作为淋洗液。

移取标准溶液，分别用6 mL的甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为洗脱液，实验发现，乙酸乙酯的洗脱能力最差；而乙腈和甲醇洗脱后，硝呋烯腙的回收率均约为98%，本实验选用甲醇作为洗脱溶液。

2.4 线性方程与检出限

在优化的测定条件下，配制一系列不同浓度的标准溶液进行测定。以目标物定量离子的峰面积(Y)对硝呋烯腙浓度(X)绘制标准曲线。结果表明，在1.0～100.0 μg/L范围内，硝呋烯腙的质量浓度和定量离子的峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y=4 279.99+2 107.44X，r2=0.999 5。方法检出限( LOD)是以空白样品添加不同浓度的标准溶液时，经前处理后上机测定，以信噪比S/N= 3时对应的最低出峰浓度为检出浓度，并依据稀释倍数计算得出。经计算硝呋烯腙的检出限为2 μg/kg。

2.5 回收率和精密度试验

采用在空白阴性样品中添加标准溶液的方法，分别对硝呋烯腙进行3个水平的添加回收试验，每个水平进行 5次重复实验。回收率试验结果列于表2。由表2可知，硝呋烯腙的回收率为66%～82%，回收率结果比较满意。

表2 回收试验结果(n=5)

用添加水平为10 μg /kg样品重复试验5次，计算得到日内精密度；连续5天重复取样测定日间精密度，试验结果列于表3。由表3可知，方法的重现性在可接受的范围内(RSD<15%)。

表3 精密度试验结果

2.6 实际样品分析

在实验设定的检测步骤和仪器条件下，对当前日常检测的样品和市场抽查的猪肉(12例)、鸡肉(10例)样品进行了测定，检出1例猪肉样品中含有硝呋烯腙残留。

3 结语

建立了动物源性食品中硝呋烯腙残留量的液相色谱串联质谱测定方法，该方法具有快速、灵敏、准确和操作简单的特点。方法检出限为2 μg/kg，能满足动物源性食品中硝呋烯腙低残留的检测要求，也为今后制定相关检验标准提供了参考依据。

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