酶法提取紫背天葵多糖工艺的研究

覃亮，董基，路宽

(肇庆学院化学化工学院，广东肇庆526061)

紫背天葵(Begonia fimbristipula)，是秋海棠科秋海棠属的多年生无茎草本植物，为中国的特有物种，富含钙、铁等［1］，营养价值较高。药学试验表明，紫背天葵性味甘、凉，有清热解毒、降血糖、活血止咳、消炎、抗恶性细胞增长［2］等药用价值。多糖是其营养成分之一，近年来发现许多中药富含活性多糖成分［3］。目前我国对紫背天葵化学成分的研究多见于色素［4-5］等方面，对其多糖的研究尚不多见。相比于常规酸、碱浸提法及热水浸提法［6］，采用酶法提取植物多糖类物质，具有条件温和、操作简单等优点。本实验选用纤维素酶对紫背天葵多糖的提取工艺进行研究，以水溶性多糖提取率为指标，建立酶法提取紫背天葵多糖的最佳工艺，为紫背天葵多糖的深入研究提供理论基础。

1 材料与仪器

紫背天葵(购自肇庆鼎湖堂，生产批号:20101110);葡萄糖对照品(Sigma公司);纤维素酶(和氏璧生物科技有限公司);石油醚(60～90℃)，95%乙醇，苯酚，硫酸均为分析纯;实验用水均为蒸馏水。

ESJ120-4型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);UV/VIS 916型紫外分光光度计(澳大利亚GBC公司);真空干燥箱(上海博讯实业有限公司);800型离心机(深圳市沙头角国华仪器厂)。

2 实验方法

2.1 多糖的提取紫背天葵用粉碎机粉碎至能通过40目筛，以石油醚为溶剂，索氏提取器回流脱脂，挥干溶剂后称取一定量的紫背天葵，以酶解温度、酶解时间、加酶量为可变因素，酶解提取紫背天葵多糖。酶解后迅速加热至90℃10 min灭酶活，离心5 min，取上清，加入3倍体积的95%乙醇4℃静置过夜，取出，离心5 min，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤3次［7］，离心5 min，收集沉淀，真空干燥，即得紫背天葵多糖。

2.2 测定方法采用苯酚-硫酸法［8］检测多糖含量，根据单因素试验结果选取因素水平进行正交试验，获得提取多糖的最佳条件。

2.3 标准曲线的绘制［9］精密称取葡萄糖对照品100 mg，置于100 mL量瓶中，加水适量使溶解，稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 mL置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得0.1 mg/mL的葡萄糖对照液。精密吸取葡萄糖对照液液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于25 mL具塞试管中，补水至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后室温放置20 min，同时用2.0 mL蒸馏水做空白，于490 nm处测定吸光值。以吸收值为纵坐标，浓度为横坐标，作标准曲线，得标准曲线拟合方程Y=7.932 9X－0.005 6(R2=0.998 1)。结果表明葡萄糖溶液在0.01～0.05 mg/mL线性关系良好。通过测定样品的吸光度，代入回归方程，计算多糖的含量。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

3.1.1 酶解温度对多糖提取率的影响称取20 g紫背天葵粉末5份，对原料脱脂后，酶解时间2 h，加2%纤维素酶，考察不同酶解温度(45，50，55，60，65℃)对多糖提取率的影响。

图1 酶解温度对多糖提取率的影响Fig.1 The influence of hydrolyzing temperature on yield of polysaccharide

由图1可知，随着酶解温度的增加，多糖提取率也逐渐增加，55℃时提取率达到最高值，然后随着温度的升高，提取率迅速下降，因此最适宜的酶解温度在55℃左右。

3.1.2 酶解时间对多糖提取率的影响酶解温度55℃，加2%纤维素酶，考察不同酶解时间(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)对多糖提取率的影响。

图2 酶解时间对多糖提取率的影响Fig.2 The influence of hydrolyzing time on yield of polysaccharide

由图2可知，随着酶解时间的增加，多糖提取率也逐渐增加。当酶解时间达2.5 h时，多糖提取率已趋于相对稳定，因此最适宜的酶解时间在2.5 h左右。

3.1.3 加酶量对多糖提取率的影响酶解温度55℃，酶解时间2.5 h，考察不同加酶量(1%，1.5%，2%，2.5%，3%)对多糖提取率的影响。

图3 加酶量对多糖提取率的影响Fig.3 The influence of the cellulase quality score on yield of polysaccharide

由图3可知，随着加酶量的提高，多糖提取率也逐渐增加。加酶量在2.5%时多糖提取率趋于稳定，因此最适宜的加酶量在2.5%左右。

3.2 多糖提取工艺的优化在上述单因素试验的基础上，设计L9(34)正交表，选择酶解温度、酶解时间和加酶量3个因素设计正交试验，选用因素及水平见表1，结果见表2(正交试验重复做3次，结果取3次测定的平均值)。

表1 正交设计试验因素水平Tab.1 The factor and level table of L9(34)

表2 正交试验结果(n=3)Tab.2 Orthogonal design and results(n=3)

由表2可知，极值R可以看出3个因素对多糖提取含量的影响，其影响主次顺序是C＞B＞A，最佳工艺条件为A2B3C3，即酶解温度为55℃，酶解时间3 h，加酶量3%。由表3可知，加酶量C对多糖提取率的影响具有显著性意义，酶解温度A、酶解时间B对多糖提取率的的影响不明显。

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

3.3 验证实验按照最佳工艺条件进行3批验证实验，多糖提取率分别为11.62%，11.58%，11.60%，其平均值为11.60%，实验结果比较稳定。

4 讨论

本实验对紫背天葵用石油醚做了脱脂处理，降低了多糖检测中脂溶性物质对实验结果的影响。水提后的醇沉物依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤，是为了排除单糖、低聚糖及苷类成分的干扰。采用酶法提取多糖，与传统的热水浸提法［10］相比，酶法工艺简单，条件温和，耗能低。本实验优化了酶法提取紫背天葵多糖的工艺，为进一步开发紫背天葵的药用价值提供了实验依据。

［1］张林和，屠春燕，于文涛，等.紫背天葵中营养成分及总黄酮分析［J］.氨基酸和生物资源，2004，26(3):3-5.

［2］柯欢，潘敏仪.紫背天葵的研究进展［J］.中国现代药物应用，2007，1(1):60-62.

［3］谭周进，谢达平.多糖的进展研究［J］.食品科技，2002(5):33-35.

［4］李忠军.天然紫背天葵多功能花青色素的提取及其光降解动力学研究［J］.安徽农业科学，2010，38(16):8685-8686.

［5］孙军德，温立丽，鲁婷婷，等.桑黄液体发酵菌丝体多糖提取条件的优化［J］.沈阳农业大学学报，2009，40(3):322-325.

［6］李鹏程，张本才，陈战国.正交试验法优化太白泡沙参总多糖的提取工艺［J］.中国中药杂志，2008，33(6):1266-1268.

［7］熊伟，谭德勇，陈贵元，等.云南天然钝顶螺旋藻片多糖提取工艺的正交实验优化与脱色脱蛋白方法研究［J］.时珍国医国药，2010，21(11):2925-2927.

［8］邬卫东，张晓文.硫酸-苯酚法测定枸杞多糖含量［J］.中草药，2003，34(3):38-40.

［9］施思，陈炼红，伍红.苦丁茶多糖提取工艺条件的优化研究［J］.西南民族大学学报:自然科学版，2010，36(6):983-987.

［10］孙庭阁，赵瑞萌，张玲.热水浸提法提取黄精多糖最佳工艺研究［J］.泰山医学院学报，2010，31(2):128-130.