载基因脂质体用于治疗肿瘤的最新研究进展*

智 利 王立强 许瑞安 刁 勇

（华侨大学分子药物研究所，福建泉州 362021）

基因药物经历了几十年的研发已经从实验室研究发展进入临床试验和应用阶段，要使临床更广泛地使用基因治疗所必须突破的一个瓶颈是发展有效的基因治疗载体。一种理想载体应同时满足高转染活性和低毒性。脂质体介导的基因转移被认为是目前最有前途的基因治疗方法，已被美国癌症协会批准为临床基因治疗的第一方案[1]。近年来脂质体的研究已经从单一功能向多功能脂质体的方向发展，使得阻碍临床应用的毒性、稳定性、靶向性等问题通过新材料、新技术、新治疗方案的研究取得了不同程度的突破。本文对几种新型的载基因脂质体用于治疗肿瘤的最新研究进展进行综述。

1 阳离子脂质体

阳离子脂质体用于基因治疗已有20多年历史，是现今研究最为详尽的一种转染脂质体。Joanna等[2]的研究表明复合物粒径在200nm～1μm时，复合物通过细胞膜穴样内陷作用进入细胞，有效避免了溶酶体对DNA的降解。通过新工艺、新技术及新复合材料的实验研究获得的专属性更强的阳离子脂质体是近年来研究者们关注的焦点。刘洋等[3]由十八烷胺(SA）/DOPE通过薄膜超声-吸附-冷冻干燥法制备的载反义寡核苷酸(asODN）阳离子脂质体对机体的免疫原性小，用海藻糖做冻干保护剂，冻干后4℃放置1个月稳定性良好。Charoensit[4]用维甲酸结合胆固醇和DOTAP制备的阳离子脂质体介导IL-12质粒DNA，对小鼠静脉注射后29d存活率仍为100%，而没有结合维甲酸的阳离子脂质体组小鼠存活率仅为60%，表明维甲酸的结合显著延长小鼠的存活时间。

研究脂质体结构与功能间的关系是设计合理的脂质体的基础，阳离子脂质体与DNA亲和力高易形成复合物，然而高亲和力可能是转染的限制性因素，因为在细胞质和细胞核中脂质体/DNA的高亲和力会导致分离困难，转染率降低。

2 长循环脂质体

长循环脂质体是通过亲水性长链对脂质体进行修饰，在脂质体表面形成水化层，降低网状内皮系统(RES）的摄取，从而延长脂质体在血液循环中的时间，以获得更充足的时间到达靶向部位。有研究表明粒径是影响长循环脂质体循环时间的重要因素。Awasthi等[5]的研究显示，脂质体经PEG修饰后粒径在160～220nm范围时，肝摄取量最小，脾摄取量适中，血液循环量达到最大值，是最适合长循环的脂质体粒径。脂质体中PEG含量也会显著影响循环时间进而影响肿瘤靶向性。Emmanuel等[6]研究发现摩尔百分数DSPE-PEG200020%、DC-Chol 50%制备的PEG修饰的阳离子脂质体对小鼠静脉注射后在血液循环中的半衰期长达12.5h，并且在肿瘤部位的累积比无PEG修饰脂质体高3倍，证明了高PEG含量、高阳性成分含量制备的脂质体既能延长循环时间又增加了肿瘤靶向性。在长循环脂质体的PEG末端连接小分子基团会对转染效率及毒性造成影响。Hyun等[7]用聚-L-精氨酸-PEG复合物来修饰阳离子脂质体，转染人肝癌细胞系H4II-E时分别比未修饰阳离子脂质体和PEG修饰阳离子脂质体转染率高10.26%和17.65%，并且此时脂质体在H4II-E和HepG2细胞系中细胞毒性是最小的。

3 p H敏感脂质体

1993年Nabel用DOPE制备载目的基因的pH敏感脂质体直接瘤内注射治疗黑色素瘤，结果表明其具有一定疗效且对患者无危害，这是脂质体介导基因治疗的首次临床实验。然而，pH敏感脂质体介导基因转染的效率不如阳离子脂质体高，这主要是因为后者的携载效率高达100%[8]。Bellavance等[9]结合了二者的优点，用DOPE和DC-Chol制备了粒径80nm的pH敏感的阳离子脂质体，转染神经胶质瘤细胞F98和U-118，在两种细胞系中均是6h内有明显的内吞作用，转染后12h进入细胞核，而不含DOPE的阳离子脂质体的胞内传递不明显。采用特殊材料或结合抗体、PEG等制备特殊性能的pH敏感脂质体能达到提高靶向性和转染效率的目的。Reddy等[10]用N-柠康酰基-二油酰磷脂酰基-乙醇胺(C-DOPE）制备pH敏感脂质体，并连接了PEG和叶酸，此脂质体在中性条件下稳定，pH为5时C-DOPE迅速水解成DOPE，使脂质体膜与胞内体膜发生融合而释放DNA。作为DNA转移载体，大大提高了微酸性环境下过表达叶酸受体的肿瘤细胞的转染效率。

4 免疫脂质体

国外的一些公司正在开发抗肿瘤免疫脂质体，加拿大Biomira公司在用人工合成的抗原开发脂质体疫苗BLP25，该疫苗可以使机体对肿瘤相关抗原mucin MUC1产生特异性的细胞免疫反应。INEX公司正在进行Oligovax(一段具有免疫增强活性的寡核苷酸）和TRP-2(tyrosinase related protein-2，一种黑色素瘤相关抗原）联用治疗黑色素瘤的研究。

虽然免疫脂质体在体外表现出了很好的靶向特性，但连接在脂质体表面的抗体能诱发RES对脂质体的吞噬而导致体内靶向效率不尽如人意，一个有效的解决办法就是将免疫脂质体技术和PEG修饰结合而达到理想的靶向效率。贝伐单抗抗体能够在表达VEGF的肿瘤细胞选择性累积，Kuesters等[11]在长循环阳离子脂质体的PEG末端连接了贝伐单抗免疫调节剂，结果表明贝伐单抗的连接增加了人胰腺癌细胞系Capan-1、HPAF-II和PANC-1和表达VEGF的内皮细胞系MS1-VEGF对脂质体的摄取，明显增加了脂质体在肿瘤组织和肿瘤血管的靶向性。然而，Kirpotin等[12]提供的实验数据表明抗HER2免疫脂质体与抗原的结合并没有增加脂质体在肿瘤部位的累积。作者认为定位肿瘤的限速步骤是脂质体从肿瘤血管的渗漏，而抗原抗体相互作用不会促进这一过程。Zhou等[13]研究了脂质体相关的配体亲和力和密度对脂质体在肿瘤细胞摄取的影响，结果表明配体的密度对于细胞摄取脂质体是很重要的，配体密度高时，高亲和力就不是必须的了。

5 受体介导的脂质体

叶酸受体(FR）在肿瘤细胞膜表面的表达可比正常组织高出100～300倍，叶酸受体的激活能引发癌细胞增殖、凋亡、迁移以及肿瘤血管增生有关的主要下游级联信号转导。Hanjie等[14]合成了赖氨酸壳聚糖十八烷基季铵盐(OQLCS），制备了粒径160nm的叶酸-PEG修饰的阳离子脂质体，荧光显微镜和流式细胞仪检测发现，由于叶酸介导的内吞作用使得脂质体在体外人乳腺癌细胞系MCF-7中转染活性显著增加。

转铁蛋白可协助血浆糖蛋白运载铁离子至正常细胞，肿瘤细胞由于快速生长对铁离子的需求相对大于正常细胞，往往都过度表达转铁蛋白受体(TR）。Pirollo等[15]用转铁蛋白修饰的阳离子脂质体包封抑癌基因RB94质粒，尾静脉注射给膀胱癌小鼠，Western blot检测到肿瘤部位RB94基因有显著表达，并且长达150d肿瘤无明显增长，而同剂量的无转铁蛋白修饰组没有明显信号，表明经转铁蛋白修饰显著增强了阳离子脂质体的肿瘤细胞靶向性。

此外，用PEG和抗体修饰载DNA脂质体，能够显著提高脂质体对肿瘤细胞的靶向性。Pirollo等[16]研究表明抗体和PEG修饰的载DNA脂质体，外源基因在肿瘤细胞中的表达是单纯由抗体修饰的载DNA脂质体的2倍，说明抗体和PEG的共同修饰起到了协同作用。

6 细胞穿膜肽修饰的脂质体

一种新型的高效运输载体-蛋白转导域(protein transduction domains，PTDs）或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs）修饰的脂质体是把一些特殊蛋白质中的一小段氨基酸序列连接到脂质体上，能穿透细胞膜、细胞核膜，携带大分子物质进入胞质和胞核发挥生物效应[17]。2004年Wadia等[18]提出的CPPs连接大分子(分子量＞30000Da）转入细胞的主要机制是巨胞饮作用。

TATp是最常用的CPPs，来源于HIV-1编码的转录激活因子。Tseng等[19]研究发现TATp修饰的脂质体的转移与连接到脂质体表面的肽分子的数量是成比例的，连接的TATp越多越易进入细胞。Gupta等[20]用TATp修饰的脂质体载质粒GFP(pEGFPN1），粒径250nm，对裸鼠脑肿瘤进行瘤内注射结果显示，与对照组未修饰脂质体相比，明显增强了目的基因在肿瘤细胞的表达而不影响肿瘤附近的正常细胞。

八聚精氨酸(R8）是另一个广泛使用的CPPs，摄取时细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖作为非特异性受体[17]。Zhang等[21]用R8修饰的脂质体载siRNA在SK-MES-1肺癌细胞中的转染效率显著高于Lipofectamine 2000介导的转染，在血浆中显示了很好的稳定性，并且能有效抑制靶基因的表达，明显降低了肿瘤细胞的增殖。

近几年提出了“智能”脂质体(“smart”liposome）的概念，即在脂质体传递的第一阶段非特异性的细胞穿透功能被聚合物保护层掩蔽，当脂质体累积到靶部位后，聚合物保护层或特异性配体在局部的病理条件下(异常的pH或温度）分离，暴露出细胞穿透功能，传递药物到细胞中。见图1。Sawant等[22]制备了PEG-PE和TATp修饰的智能脂质体，PEG和PE间由pH敏感的腙键连接，TATp连接到PEG末端。在pH 5.0～6.0孵育15～30min后脂质体被癌细胞大量摄取，由于PEG-PE间腙键被水解，暴露了TATp的功能，发生巨胞饮作用。给小鼠瘤内注射此脂质体介导的pGFP 72h后目的基因大量表达，而TATp和非pH敏感的PEG修饰的脂质体介导pGFP在肿瘤细胞中只有很少的转染，因为PEG保护层使得脂质体与细胞膜间形成立体阻碍，隐蔽了TATp的功能。

CPPs修饰的脂质体技术为脂质体的跨膜转导提供了新思路，然而，肽类难以预料的翻译后修饰及前体肽剪切位点的不确定性，肿瘤细胞表面受体表达的复杂性和多样性是其广泛应用的限制因素。因此，PTDs修饰的脂质体的研究尚需进一步努力，但可以肯定的是，这是一种很有前途的靶向给药系统。

图1 “智能”脂质体结构

脂质体材料的选择需要综合考虑各方面的因素，如与DNA的亲和力、在血液中的稳定性、与细胞膜的融合能力等。近几年出现的新材料MS09、PEI800-Chol等，对基因转染效率高、毒性小，极具应用潜力。同时新的制备工艺、SUV融合法、改进的乙醇注入法、薄膜-冻融法等，也使脂质体的性能有一定程度的改善。

除了制备材料的选择和制备方法的改进，目前研究最多的是将多种新型脂质体技术综合应用，如用PEG修饰的同时连接特异性配体，通过共同修饰达到协同作用、进一步揭示脂质体在体内的转移机制及其与细胞之间的反应机制等也是该领域研究的重点之一。

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