SDF-1/CXCR4生物学轴在乳腺癌中的表达及其临床意义

宦大为，惠林萍，滕猛，王巧欢，张文竹，张弘

（1.沈阳医学院奉天医院病理科，沈阳 110024；2.中国医科大学基础医学院病理教研室，沈阳 110001；3.中国医科大学附属第四医院中心实验室，沈阳 110032）

SDF-1/CXCR4生物学轴在乳腺癌中的表达及其临床意义

宦大为1，2，惠林萍3，滕猛1，王巧欢2，张文竹2，张弘2

（1.沈阳医学院奉天医院病理科，沈阳 110024；2.中国医科大学基础医学院病理教研室，沈阳 110001；3.中国医科大学附属第四医院中心实验室，沈阳 110032）

目的检测趋化因子基质细胞衍生因子1（SDF-1）及其受体CXCR4在乳腺浸润癌、导管原位癌及癌旁组织中的表达，分析两者与乳腺浸润癌临床病理学特征的关系，探讨SDF-1/CXCR4生物学轴在乳腺癌发生发展过程中的的作用。方法 采用免疫组化方法检测80例乳腺浸润癌、15例导管原位癌和15例癌旁组织中SDF-1及CXCR4蛋白的表达。应用RT-PCR检测40例乳腺浸润癌、5例导管原位癌和5例癌旁组织中SDF-1及CXCR4mRNA的表达。结果 免疫组化检测结果显示，SDF-1、CXCR4在乳腺浸润癌与导管原位癌，导管原位癌与癌旁组织中的表达差异均有统计学意义（P＜0.05），其中CXCR4表达与乳腺癌的淋巴结转移和分期有关（P＜0.05）。RT-PCR检测结果显示，SDF-1与CXCR4mRNA在乳腺浸润癌与导管原位癌，导管原位癌与癌旁组织中的表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA在乳腺浸润癌中的表达呈正相关（P＜0.05）。结论SDF-1/CXCR4生物学轴在促进乳腺癌的发生发展及侵袭转移过程中起促进作用。

SDF-1/CXCR4生物学轴；乳腺癌；免疫组化；RT-PCR

SDF-1/CXCR4生物学轴是指由趋化因子基质细胞衍生因子 1（stromal-derived factor-1，SDF-1）及其特异性受体CXC趋化因子受体4（c-x-c chemokine receptor 4，CXCR4）相互作用而构成的一个与细胞间信号转导、细胞迁移有密切关系的耦联分子对，广泛地表达于多种细胞和组织中。SDF-1/CXCR4生物学轴参与包括引起肿瘤细胞产生趋化运动在内的多种病理生理过程，而肿瘤细胞的趋化运动与肿瘤的侵袭转移存在密切关系。肿瘤细胞的定向运动是肿瘤浸润转移的重要过程，研究显示，SDF-1/CXCR4生物学轴的激活在乳腺癌向特定组织器官转移的过程中起关键作用［1］，但联合检测SDF-1与CXCR4在乳腺癌中的表达，从蛋白及mRNA水平探讨二者在乳腺癌发生发展过程中的协同作用方面的研究较少。因此，本研究联合检测了SDF-1、CXCR4在乳腺浸润癌、导管原位癌及癌旁组织中的表达，旨在明确SDF-1/CXCR4生物学轴在乳腺癌生长、浸润、转移中的作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源：免疫组化标本取自沈阳医学院奉天医院病理科2002年9月至2007年9月手术切除的石蜡标本，包括乳腺浸润癌标本80例，乳腺导管原位癌标本15例，乳腺癌癌旁组织15例（取自距肿瘤边缘5cm的非癌乳腺组织）。乳腺浸润癌按WHO（2003）乳腺肿瘤分类进行分型：浸润性导管癌61例，浸润性小叶癌5例，髓样癌4例，神经内分泌癌4例，浸润性微乳头状癌2例，黏液癌2例，化生性癌1例，大汗腺癌1例。对61例浸润性导管癌进行组织学分级：I级8例，Ⅱ级41例，Ⅲ级12例。按照UICC对全部乳腺浸润癌进行病理分期：I期13例，Ⅱ期42例，Ⅲ期25例。标本经10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋保存。患者均为女性，年龄30～84岁，平均年龄53岁。

RT-PCR标本取自沈阳医学院奉天医院病理科2006年9月至2007年12月手术切除的新鲜标本，包括乳腺浸润癌标本40例，乳腺导管原位癌标本5例，乳腺癌癌旁组织5例（取自距肿瘤边缘5cm的非癌乳腺组织）。乳腺浸润癌按WHO（2003）乳腺肿瘤分类分型：浸润性导管癌29例，浸润性小叶癌3例，髓样癌4例，黏液癌2例，浸润性微乳头状癌1例，化生性癌1例。新鲜组织在切除术后立即置于-80℃保存。患者均为女性，年龄30～80岁，平均年龄54岁。

1.1.2 试剂：兔抗人SDF-1及CXCR4多克隆抗体浓缩型（武汉博士德生物工程有限公司），SP法免疫组化试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司）。RNAiso Plus、琼脂糖（大连Takara公司），TIANScript cDNA第一链合成试剂盒、PCR Mix（北京天根公司），Trans DNA MarkerⅠ（北京全式金公司）。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学：采用SP法，具体操作按照说明书进行。SDF-1和CXCR4抗体均按1︰100倍稀释；PBS代替一抗做阴性对照，已知阳性切片做阳性对照；4℃过夜；AEC显色5～10min；苏木素复染；AEC封片胶及中性树胶封片。结果判断：SDF-1、CXCR4阳性着色均主要分布于细胞质，染色呈黄色至红色；采用双评分半定量法进行评分，高倍镜下根据染色强度和阳性细胞所占百分比例判定；染色强度评分标准：不着色0分，黄色1分，桔黄色2分，红色3分。阳性细胞所占比例评定标准：阳性细胞率<25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。两种评分相加，0～1分为阴性（－），2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。

1.2.2 RT-PCR：总RNA提取过程严格按照RNAiso Plus试剂说明书进行。总RNA纯度和浓度使用紫外分光光度计（NanoPhotometer，Germany）测定，经测定所用样品的A260/A280比值都在1.8～2.0之间。反转录过程也按试剂说明书进行操作。引物序列分别为：CXCR4上游引物为 5′AAAATCTTCCTGCCCACC 3′，下游引物为 5′GCCAACATAGACCACCTT 3′；SDF-1上游引物为 5′GCTTTGAGTGACTGGGTT 3′，下游引物为 5′GTGGCAAGATGATGGTTT 3′；内参GAPDH上游引物为 5'GAAGGTCGGAGTCAACGGAT 3'，下游引物为 5'CCTGGAAGATGGTGATGGG 3'。PCR循环条件为：94℃预变性3min，94℃ 变性 30s，59.5℃（CXCR4）、56.5℃（SDF-1）、58.5℃（GAPDH）退火 30s，72℃ 延伸 1min，35个循环后于72℃ 延伸5min。PCR反应产物的大小分别为 366bp（CXCR4）、124bp（SDF-1） 和 224bp（GAPDH），PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。使用紫外光凝胶照像，经Image J软件进行灰度测定，实验重复3次。将CXCR4和SDF-1的灰度值与GAPDH灰度值的比值进行分析。

1.3 统计学分析

数据处理采用SPSS 13.0统计软件，用χ2检验对SDF-1、CXCR4在浸润性乳腺癌、导管原位癌及癌旁组织中的表达结果进行分析；用Spearman相关检验对SDF-1、CXCR4在浸润性乳腺癌中表达的相关性进行分析；用非参数Mann-Whitney U检验和非参数Kruskal Wallis Test检验对SDF-1、CXCR4表达与乳腺浸润癌临床病理学特征的相关性进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化

2.1.1 SDF-1、CXCR4蛋白在乳腺浸润癌、导管原位癌及癌旁组织中的表达：SDF-1、CXCR4免疫组化阳性产物主要定位于细胞质内。在乳腺癌旁组织、导管原位癌和乳腺浸润性癌中，SDF-1阳性表达率分别为 33.33%，53.33%，87.50%（图 1）；CXCR4分别为20.00%，53.33%，80.00%（图2）。两者在癌旁组织、浸润癌的阳性表达率与导管原位癌相比差异均有统计学意义（P＜0.05），伴随病变进展过程均有表达增高的趋势。见表1。

表1癌旁组织、导管原位癌与乳腺浸润癌S D F-1与C X C R 4免疫组化结果T a b.1T h e e x p r e s s i o n o f S D F-1a n d C X C R 4p r o t e i n i n a d j a c e n t t i s s u e s，d u c t a l c a r c i n o ma i n s i t u a n d b r e a s t c a r c i n o ma++ +++ - + ++ +++Adjacent tissues 15 10 5 0 0 12 3 0 0Ductal carcinoma in situ 15 7 7 1 0 7 7 1 0Breast carcinoma 80 10 32 36 2 16 39 24 1Group n SDF-1 CXCR4-+

2.1.2 SDF-1、CXCR4蛋白在乳腺浸润癌中表达相关：相关性分析结果发现，SDF-1与CXCR4蛋白在乳腺浸润癌中的表达呈正相关（P＜0.05），见表2。

2.1.3 SDF-1、CXCR4蛋白的表达与乳腺癌临床病理学特征的关系：组间差异比较结果显示，CXCR4的表达与入组乳腺浸润癌患者的年龄和肿瘤的直径、组织学分级及癌的类型无关，而与淋巴结转移、临床分期有关（P＜0.05），且随着淋巴结转移数目的增多，临床分期的增高，表达阳性率也逐渐提高，见表3。SDF-1与上述临床病理学特征均无关，见表4。

表2S D F-1、C X C R 4在乳腺浸润癌中的表达的相关性分析T a b.2T h e c o r r e l a t i o n o f S D F-1a n d C X C R 4e x p r e s s i o n s i n b r e a s t c a r c i n o ma SDF－1-+ ++ +++- 8 6 2 0 0.368 ＜0.05+ 1 18 20 0++ 1 8 13 2+++ 0 0 1 0CXCR4r P表3C X C R 4与乳腺癌临床病理学特征的关系T a b.3T h e c o r r e l a t i o n o f C X C R 4p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d t h e c l i n i c o p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s o f b r e a s t c a r c i n o ma CXCR4-+++ +++Age（year）Characteristic n Z χ2 P-0.011 0.992<53 46 9 23 13 1≥53 34 7 16 11 0Diameter of tumor（cm）0.897 0.638＜2 21 4 11 6 02～5 44 9 23 11 1≥5 15 3 5 7 0Histological grade﹡3.311 0.191Ⅰ8242 0Ⅱ41 7 22 11 1Ⅲ12 1 4 7 0TNM stage 11.314 0.003Ⅰ13 3 7 3 0Ⅱ42 13 20 8 1Ⅲ25 0 12 13 0Lymph node metastasis（n）11.019 0.012046 14 22 9 11～3 13 2 7 4 04～9 16 0 9 7 0＞9 5 0 1 4 0Histological type-1.527 0.127Ductal carcinoma 61 10 30 20 1Others 19 6 9 4 0*Only 61cases of invasive ductal carcinoma were analyzed.

表4S D F-1与乳腺癌临床病理学特征的关系T a b.4T h e c o r r e l a t i o n o f S D F-1p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d t h e c l i n i c o p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s o f b r e a s t c a r c i n o ma+ ++ +++Age（year）Characteristic n SDF-1-Z χ2 P-0.551 0.581<53 46 6 20 18 2≥53 34 4 12 18 0Diameter of tumor（cm）0.670 0.715＜2 21 2 8 11 02～5 44 6 19 18 1≥5 15 2 5 7 1Histological grade﹡3.630 0.163Ⅰ8 2 4 2 0Ⅱ41 3 17 21 0Ⅲ12 1 4 5 2TNM stage 4.125 0.127Ⅰ13 2 6 5 0Ⅱ42 8 16 17 1Ⅲ25 0 10 14 1Lymph node metastasis（n）5.200 0.158046 9 19 17 11～3 13 1 3 9 04～9 16 0 8 8 0＞9 5 0 2 2 1Histological type-0.960 0.337Ductal carcinoma 61 6 25 28 2Others 19 4 7 8 0*Only 61cases of invasive ductal carcinoma were analyzed.

2.2 RT-PCR

2.2.1 SDF-1、CXCR4mRNA在乳腺浸润癌、导管原位癌及癌旁组织中的表达（图3）：RT-PCR结果显示，癌组织中SDF-1表达较强，癌旁组织中表达水平很低，在原位癌中仅有少量表达。CXCR4mRNA在乳腺浸润癌中呈高表达，癌旁组织中表达水平低，在原位癌中呈低表达。SDF-1与CXCR4mRNA在癌旁组织与导管原位癌、导管原位癌与浸润癌中的表达差异均有统计学意义（P＜0.05），伴随病变进展过程均有mRNA表达水平增高趋势，见表5。

表5癌旁、导管原位癌与乳腺浸润癌S D F-1、C X C R 4mR N A表达T a b.5T h e mR N Ae x p r e s s i o n o fS D F-1，C X C R 4i n a d j a c e n t t i s s u e s，d u c t a l c a r c i n o ma i n s i t u a n d b r e a s t c a r c i n o ma SDF-1 CXCR4Mean SD P Mean SD P Adjacent tissues 5 0.454 0.072 0.520 0.054Ductal carcinoma in situ 5 0.804 0.300 ＜0.051） 0.759 0.213 ＜0.051）Breast carcinoma 40 1.151 0.374 ＜0.052） 0.924 0.322 ＜0.052）1）compared to adjacent tissues；2）compared to ductal carcinoma in situ.Group n

2.2.2 乳腺浸润癌中SDF-1、CXCR4mRNA表达的相关性：SDF-1、CXCR4mRNA在乳腺浸润癌中表达的相关性分析发现，SDF-1与CXCR4的表达水平呈正相关（P＜0.05），见表6。

表6乳腺浸润癌中S D F-1、C X C R 4mR N A表达的相关性T a b.6T h e c o r r e l a t i o n o fS D F-1a n dC X C R 4i n b r e a s t c a r c i n o ma Gene Mean SD r P CXCR4 1.151 0.374 0.555 ＜0.05SDF-1 0.924 0.322

3 讨论

肿瘤细胞在实现侵袭、转移这一复杂的病理过程中，离不开癌细胞向特定组织器官的趋化和定向移动。研究显示，SDF-1与其唯一受体CXCR4的结合激活了一系列细胞间信号转导通路和效应分子，从而调节细胞的存活、增殖、趋化、迁徙和黏附［2］。目前已发现CXCR4在23种不同类型的肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体，并且与患者的预后相关［3］。Kang等［4］通过检测 120例乳腺癌组织中CXCR4的表达发现，CXCR4表达阳性与患者淋巴结转移相关；Li等［5］发现，高表达CXCR4的乳腺癌患者预后较差。研究表明，下调CXCR4的表达也可以明显抑制结肠癌［6］和前列腺癌［7］的远处转移。上述研究均提示，SDF-1/CXCR4生物学轴在肿瘤侵袭转移过程中起着非常重要的作用。

本研究中免疫组化及RT-PCR结果表明，SDF-1及其受体CXCR4的蛋白及mRNA在乳腺浸润癌与导管原位癌、导管原位癌与癌旁组织中的表达差异均有统计学意义，伴随病变进展两者均有表达增高趋势。同时，本研究结果显示，在乳腺浸润癌中，SDF-1与CXCR4mRNA的表达水平呈正相关。提示这一对受体配体在乳腺癌的发生发展及侵袭转移过程中起重要作用。

研究显示，原发肿瘤的间质细胞是SDF-1的重要资源，Allinen等［8］隔离正常乳腺组织和浸润性乳腺癌标本中的上皮细胞和间质细胞，综合分析不同细胞的基因表达时发现，与正常乳腺组织比较，SDF-1在间质细胞中的与浸润性乳腺癌相关的肌纤维母细胞的表达显著上调。Orimo等［9］发现，乳腺肿瘤间质肌纤维母细胞产生的SDF-1明显多于乳腺癌细胞或正常乳腺上皮细胞。本研究发现，CXCR4的表达与乳腺癌淋巴结转移和临床分期相关，而SDF-1与上述临床病理学特征均无相关性。Allinen和Orimo的研究为本研究SDF-1/CXCR4生物学轴中SDF-1在乳腺癌上皮细胞内表达与临床病理学特征均无相关性提供了一定的理论支持，这也说明CXCR4在乳腺癌癌细胞中的表达比SDF-1更能体现该生物学轴与乳腺癌临床病理学特征的相关性。综上所述，本研究从蛋白及mRNA水平证实了SDF-1/CXCR4生物学轴激活可以促进乳腺癌的发生发展乃至侵袭和转移。

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（编辑王又冬，英文编辑郑华川）

The Expression and Clinical Significance of the SDF-1/CXCR4Biological Axis in Breast Cancer

HUAN Da-wei1，2，HUI Lin-ping3，TENG Meng1，WANG Qiao-huan2，ZHANG Wen-zhu2，ZHANG Hong2
（1.Department of Pathology，Shenyang Fengtian Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；2.Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Central Laboratory，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo analyze the clinicopathological significance of ligand SDF-1and its receptor CXCR4expression in breast carcinoma，ductal carcinoma in situ and adjacent tissues and clarify the roles of SDF-1/CXCR4biological axis in the pathogenesis of breast cancer.MethodsSDF-1and CXCR4protein expression were examined in 80cases of breast carcinoma，15cases of ductal carcinoma in situ and 15cases of adjacent tissue by immunohistochemistry.SDF-1andCXCR4mRNA expression were determined in 40cases of breast invasive carcinoma，5cases of ductal carcinoma in situ and 5cases of normal tissue adjacent to cancer tissues by RT-PCR.ResultsThe protein and mRNA expressions ofSDF-1andCXCR4were different in breast carcinoma and ductal carcinoma in situ，ductal carcinoma in situ and adjacent tissues（P<0.05）.The expression of CXCR4protein was related to lymph node metastasis and breast cancer stage （P<0.05）.Both protein and mRNA expression of SDF-1and CXCR4were positively correlated in breast carcinoma （P<0.05）.ConclusionSDF-1/CXCR4biological axis might play an important role in promoting breast cancer growth and metastasis.

SDF-1/CXCR4biological axis；breast carcinoma；immunohistochemistry；RT-PCR

R737.9

A

0258-4646（2011）02-0166-06

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0954.018

宦大为（1971-），男，副主任医师，硕士.

张弘，E-mail：zhho2@163.com

2010-09-16