HPV16/18在泰兴地区食管鳞癌中的表达及相关性研究

周萍，王修珍，朱正龙，刘静，李霞

（1.扬州大学附属江苏省泰兴市人民医院病理科，江苏 泰兴 225400；2.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院病理学与病理生理学教研室，江苏 苏州 215123）

HPV16/18在泰兴地区食管鳞癌中的表达及相关性研究

周萍1，王修珍2，朱正龙1，刘静1，李霞1

（1.扬州大学附属江苏省泰兴市人民医院病理科，江苏 泰兴 225400；2.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院病理学与病理生理学教研室，江苏 苏州 215123）

目的探讨人乳头状瘤病毒16/18（HPV16/18）在食管鳞癌中的表达及相关性。方法 应用双探针原位杂交检测HPV16/18在72例食管鳞癌，18例正常食管黏膜，12例低级别上皮内瘤变，18例高级别上皮内瘤变中的表达并分析其与食管鳞癌的关系。结果 食管鳞癌HPV16/18阳性率为55.56%（40/72）。正常食管上皮、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变HPV16/18阳性率均明显低于食管鳞癌，有统计学差异（P＜0.05）。结论HPV16/18与食管鳞癌的临床分期、病理分级、组织大体形态、淋巴结转移、性别、年龄、浸润深度无相关性，与食管的鳞状上皮恶变有一定相关性，可为食管鳞癌病因预防治疗提供依据。

HPV16/18；双探针；原位杂交；食管鳞形细胞癌

食管癌是常见的消化道肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。食管癌是发病率变异最大的疾病之一，高发区和低发区相差可达60倍［1］。苏北地区已成为主要的高病死率水平地区。2007-2008年两年间江苏省泰兴人民医院胸外科食管肿瘤住院病人就达750例。

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPVs）与食管癌关系的研究是从 Syrjanen 等［2，3］于 1982年首次提出并证实食管癌组织存在有HPVs感染以后开始的。到目前为止，在食管癌组织中检测到的已知 HPV 型别有 HPV6、11、16、18、30、31/33/35，其中以HPV16和18最为常见。许多学者研究了HPVs与食管癌的关系，但结论不一，不同地区食管癌HPVs感染率从0%至100%不等，文献报道食管癌高发区HPVs感染率高于低发区［4］。但有一部分学者采用敏感的PCR法并未在食管癌组织中发现有HPVs感染的存在［5］。因此，HPVs在食管癌病因中的作用目前还存在争议。本组研究通过双探针原位杂交检测食管鳞癌中高危型HPV16/18基因，并探讨HPV16/18与食管组织病变的相关性，旨在明确HPV与食管鳞癌发生的相关性，及其诱导食管癌发生的可能机制。

1 材料与方法

1．1 材料

随机抽取江苏省泰兴市人民医院2007年1月至2008年10月食管鳞癌根治术后标本72例，有完整的临床、病理资料，所有病例术前未经放疗或化疗，均经手术后病理证实为鳞状细胞癌。所有标本重新经两名富有经验的病理科医师阅片复诊，病理诊断无误。其中男性51例，女性21例；年龄38～74岁，平均（61±7）岁。肿瘤病理组织学分级：G1高分化18例，G2中分化51例，G3低分化3例；依据2009年UICC食管癌国际TNM分期标准：Ⅰ期9例、Ⅱ期51例、Ⅲ期11例、Ⅳ期1例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移47例。另设48例对照组，其中正常鳞状上皮组织18例，低级别上皮内瘤变12例，高级别上皮内瘤变18例。

1．2 方法

所有标本均经4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片厚度4μm，作HE常规染色和原位杂交检测。HPV16/18杂交液、组织细胞原位显示配套试剂盒（DAB法），PBS缓冲液均购自福州泰普生物科学有限公司。操作按试剂盒步骤进行，杂交预处理用微波高火处理30min，自然冷却后加杂交液。拷贝过夜时间不能超过16h。试验阳性对照：已知HPV16/18阳性的宫颈癌切片。

1．3 判断标准

HPV16/18原位杂交阳性信号为棕黄色颗粒，主要定位在细胞核和细胞质内。对肿瘤细胞的观察标准：阳性（+）：细胞核或胞质内见棕黄色颗粒；阴性（-）：细胞不着色。

1．4 统计学分析

结果采用SPSS 16.0统计软件对数据进行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 HPV16/18在食管组织中的表达

HPVs原位杂交阳性信号位于细胞核和/或胞质内。食管鳞癌（图1）中阳性细胞多位于肿瘤组织的中央区域，层状分布特征消失，分布不均匀，少数病例有较强的信号弥漫分布。高级别上皮内瘤变上皮（图2），阳性细胞层次不明显，多数病例占上皮全层2/3厚以上，表层细胞阳性信号粗块状，近基底细胞信号颗粒状。正常食管上皮黏膜阳性信号多位于表层细胞上1/3，越近表层，阳性细胞数越多，杂交点粗而多，甚至呈块状。低级别上皮内瘤变病例组12例均未见阳性。

2．2 HPV16/18表达与食管鳞癌临床分期、病理分级和临床特征的关系及HPV16/18在食管正常上皮、瘤变和癌变组织中表达的比较

正常食管上皮HPV16/18阳性率明显低于食管癌，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。高级别上皮内瘤变HPV16/18阳性率低于食管癌，有统计学意义（P＜0.05）。低级别上皮内瘤变HPV16/18阳性率明显低于食管癌，差异有统计学意义（P＜0.01）。而HPV16/18阳性率在正常食管上皮与低级别上皮内瘤变、正常食管上皮与高级别上皮内瘤变及低级别上皮内瘤变与高级别上皮内瘤变上，差异没有统计学意义（P＞0.05）。HPV16/18的表达与食管鳞癌的病理分期、病理分级、肿瘤大体形态、性别、淋巴结转移、年龄、肿瘤浸润深度均无相关性（P＞0.05）。见表1～3。

表1H P V 16/18表达与食管鳞癌临床分期、病理分级的关系T a b.1H P V 16/18e x p r e s s i o na n di t s r e l a t i o n s h i pw i t he s o p h a g e a l s q u a mo u s c a r c i n o ma c l i n i c a ls t a g i n g a n d p a t h o l o g i c g r a d i n g HPV16/18expressing Positive Negative Clinical stging 72StageⅠ 9 4（44.44%） 5StageⅡ 51 29（56.86%） 22StageⅢ 11 6（54.55%） 5StageⅣ 1 1（100%） 0Pathological grading G1 18 9（50%） 9G2 51 30（58.82%） 21G3 3 1（33.33%） 2Item n

表2H P V 16/18表达与食管鳞癌临床特征的关系T a b.2H P V 16/18e x p r e s s i o na n di t s r e l a t i o n s h i pw i t he s o p h a g e a l s q u a mo u s c a r c i n o ma c l i n i c a l f e a t u r e s HPV16/18expression Positive Negative LN metastasis 72Positive 25 14（56.00%） 11Negative 47 26（55.32%） 21Age（year）＜50 5 1（20.00%） 4≥50 67 39（58.21%） 28Sex Male 51 28（54.90%） 23Female 21 12（57.14%） 9Gross morphology Ulcerative type 27 15（55.56%） 12Medullary type 28 18（64.29%） 10Constriction type 14 6（42.86%） 8Fundus type 3 1（33.33%） 2Invasive type T1 10 5（50.00%） 5T2 38 19（50.00%） 19T3 24 16（66.67%） 8LN，lymph node.Clinical features n表3正常食管上皮、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、食管癌H P V 16/18表达的比较T a b.3T h ec o mp a r i s i o no f H P V 16/18e x p r e s s i o na mo n gn o r ma l e s o p h a g e a l e p i t h e l i u m，l o w-g r a d ei n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s ia，h i g h-g r a d e i n t r a e p i t h e l i a ln e o p l a s i a a n d e s o p h a g e a l c a r c i n o ma HPV16/18expression Positive Negative NEE 18 4（22.22%）1） 14LIN 12 0（0）2） 12HIN 18 3（16.67%）3） 15ECA 72 40（55.56%） 32NEE，normal esophageal epithelium；LIN，low-grade intraepithelial neoplasia；HIN，high-grade intraepithelial neoplasia；ECA，esophageal carcinoma.1）P＜0.05vs ECA；2）P＜0.01vs ECA；3）P ＜ 0.05vs ECA.Histological type n

3 讨论

HPVs是小分子DNA肿瘤病毒，属乳头瘤病毒亚组，HPVs共有8个主要的开放读框即E6、E7、E1、E2、E4、E5、L1和 L2ORFs。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6及E7基因多整合入宿主基因组，在细胞恶性转化中起关键作用，被公认为病毒癌基因。Münger等［6］研究发现E6、E7编码的E6、E7蛋白可引起子宫颈上皮细胞永生化。体外研究表明，高危型E6能与P53蛋白结合形成复合物，通过依赖泛素的蛋白酶系统诱导p53蛋白降解，使其失去抑癌作用，导致细胞增殖。E7可与成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因蛋白（Rb）的p21结合，导致p21cipl/WAF表达降低，是HPVs致癌的主要机制［7］。

HPVs感染食管上皮黏膜是一个长期过程，可潜伏在细胞内若干年，一旦机体免疫力降低，潜伏的病毒可恢复活动。其感染途径可能与呼吸道感染相似，即胎儿宫内感染或生产过程中感染，以及口－生殖器非正常接触等。既往研究中认为：HPVs是一种非溶性病毒，其感染与生长周期依赖于基底细胞的分化。在感染初期，HPVs始终存在于上皮细胞中并保持少量复制，编码少量非分泌性蛋白，并尽量延迟在分化上皮中的表达，在复制与装配过程中也没有细胞溶解和细胞病理性死亡，因而此时机体检测不到病毒与病毒蛋白，限制了系统抗原的提呈，无法产生“危险信号”警示免疫系统。在感染初期，HPVs仅作为游离体进入宿主细胞，但随着疾病进展，在绝大部分宫颈浸润癌中都存在着HPVs与宿主基因组的整合［8］。这种整合可使E2开放读码框架失活，由于E2是HPVs中唯一具有抑制病毒复制转录的基因，其失活使E6与E7的转录不受限制而能继续大量进行，从而使基因的微小突变可能得以逐步积累，经过长达10～20年多步骤发展过程诱发宫颈癌。

在HPVs感染与食管病变程度的关系研究中，师晓天等［9］采用食管脱落细胞学检查发现河南省高发区食管癌患者（80%）及正常志愿者（46%）以及非癌食管上皮细胞均有HPV高危型（16、18）感染。在正常志愿者中感染率随细胞癌前病变的加重而增高。姚品芳等［10］应用原位杂交方法检测82例食管癌组织中HPVs感染情况，结果在3组研究对象中均发现有HPVs感染，分别为30.0%、25.0%、31.8%。

本组研究中发现食管鳞癌患者HPV16/18表达阳性率为55.56%，HPV16/18原位杂交阳性信号位于细胞核和/或细胞质内。正常食管上皮、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变HPV16/18阳性率均明显低于食管鳞癌，差异有统计学意义（P＜0.05），结果提示HPV16/18与食管的鳞状上皮恶化有一定相关性，但与食管鳞癌的病理分期、病理分级、肿瘤大体形态、性别、淋巴结转移、年龄、肿瘤浸润深度均无相关性（P＞0.05）。泰兴地区食管鳞癌组织中存在HPVs感染，HPVs感染可能是其发病的危险因素之一。HPVs感染可能与泰兴地区食管鳞癌的发生存在联系，但最终确定HPVs感染与泰兴地区食管癌的关系，还需要大量检测本地区正常人群中HPVs感染情况，并进行追踪随访。且其发病机理是否与宫颈癌相同，还有待进一步研究。

［1］贲晓松，王沐廷，周子浩．NCCN 食管癌临床指引（2008.1版）［J］．循证医学，2008，8（6）：360-373.

［2］Syrjanen KJ，Pyrhonen S，Aukee S，et al.Squamous cell papilloma of the esophagus：a tumor probably caused by human papilloma-virus（HPVs）［J］.Diag Histo Pathol，1982，5：291-296.

［3］Syrjanen KJ.HPV infections and oesophageal cancer［J］.Clin Pathol，2002，55（10）：721-728.

［4］Peixoto GD，Hsin LS，Snijders P，et al.Absence of association between HPV DNA，TP53codon72polymorphism，and risk of oesophageal cancer in a high-risk area of China［J］.Cancer Lett，2001，162（2）：231-235.

［5］Gao GF，Roth MJ，Wei WQ，et al.No association between HPV infection and the neoplastic progression of esophageal squamous cell carcinoma：result from across-sectional study in a high-risk region of China［J］.Int J Cancer，2006，119（6）：1354-1359.

［6］Münger K，Baldwin A，Edwards KM，et al.Mechanisms of human papillomavirus induced oncogenesis［J］.Virology，2004，78（21）：11451-11460.

［7］张伟，李艳红，王兴国，等．HPV16/18E6基因、c-erbB-2及 p21ras基因蛋白的表达与宫颈癌的关系［J］．诊断病理学杂志，2000，7（3）：196-198.

［8］Arias-Pulido H，Peyton CL，Joste NE，et al．Human papillomavirus type 16integration in cervical carcinoma in situ and in invasive cervical cancer［J］．Clin Microbiol，2006，44（5）：1755-1762.

［9］师晓天，路常东，王中，等．人类乳头状瘤病毒感染和食管癌发生的相关性研究路径［J］，中国肿瘤，2007，16（2）：83-84.

［10］Yao P，Li G，Li J，et al.Evidence of human papilloma virus infection and its epidemiology in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Wor J Gastroen，2006，12（9）：1352-1355.

（编辑裘孝琦，英文编辑王又冬）

Expression of HPV16/18in Esophageal Squamous Carcinoma in Taixing Area

ZHOU Ping1，WANG Xiu-zhen2，ZHU Zheng-long1，LIU Jing1，LI Xia1
（1.Department of Pathology，Taixing People’s Hospital，Yangzhou University，Taixing 225400，China；2.Department of Pathology and Pathol-physiology，Foundmental Medicine and Bioscience College，Medical Branch of Suzhou University，Suzhou 215123，China）

ObjectiveTo explore the expression of human papilloma virus 16/18（HPV16/18）in esophageal squamous carcinoma.Method We applied double-exploring probe to detect HPV16/18in 72cases of esophageal squamous carcinoma，18cases of normal esophageal normal mucosa，12cases of low-grade intraepithelial neoplasia and 18cases of high-grade intraepithelial neoplasia and studied its relationship with esophageal squamous carcinoma.ResultsThe positive rate of HPV16/18in esophageal squamous carcinoma was 55.67%（40/72）.The positive rate of HPV in normal esophageal epithelium，high-grade intraepithelia neoplasia and low-grade intraepithelial neoplasia was remarkably lower than that of esophgeal carcinoma and it had statistic significance（P<0.05）.ConclusionHPV16/18had no correlation with the clinical staging，pathological grading，gross morphology，lymph node metastasis，sex，age and the invasive depth of esophageal squamous carcinoma，but had some correlation with maglignant transformation of esophageal squamous epithelium and can provide proof for preventive treatment of esophageal squamous carcinoma.

HPV16/18；double-exploring probe；in-situ hybridation；esophageal squamous carcinoma

R735.1

A

0258-4646（2011）02-0172-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0954.019

周萍（1978-），女，主治医师，硕士.E-mail：txapple78@sina.com.cn

2010-09-04