牛蛙消化道黏膜5种酶的分布

韦金鑫 郭 慧 宋 华 周乃珍 魏 超 张盛周

(安徽师范大学生命科学学院,生物环境与生态安全省级重点实验室,芜湖 241000)

牛蛙(Rana catesbeinana)隶属两栖纲无尾目蛙科蛙属,是一种大型蛙,其生长速度快,肉质细嫩,肉味鲜美,是低脂肪高蛋白的高级营养食品。在我国,牛蛙的人工养殖已得到了大规模推广。目前对牛蛙的一般生物学研究较多,在消化酶方面,奚刚等[1]对牛蛙幼体发育阶段消化道蛋白酶和淀粉酶的活力变化进行了研究,朱联九等[2]对成体牛蛙消化液中主要消化酶的活力进行了研究,但牛蛙消化道黏膜中与消化吸收相关酶的分布尚未见报道。本文拟对牛蛙消化道黏膜碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、ATP酶、酯酶和脂酶等5种酶的分布进行研究,旨在增进对牛蛙消化机能的认识,为牛蛙的人工养殖提供基础资料。

材料和方法

1.材 料

成体牛蛙6只,重250-300 g,取自芜湖市南陵县仙坊镇牛蛙养殖场。穿刺毁髓,解剖,迅速取出完整消化道,用生理盐水快速洗净,按下列各部位取材:食道、胃贲门部、胃体、胃幽门部、十二指肠、空肠、回肠和直肠,置于-70℃的冰箱冷冻。参照田玉旺等[3]的方法制作冰冻切片,切片厚度7μm。甲醇固定5-10min,置于-20℃冰箱保存备用。

2.组 织化学染色方法

酶的组织化学方法参照文献[3]中进行,略有改变。

2.1 ALP ALP作用液成分为碱性磷酸酶缓冲液 (100mmol/L NaCl、5mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl,pH 9.2-9.4)、5% 四唑硝基蓝(NBT)和5%5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)。将组织切片浸于作用液显色20min,蒸馏水浸洗。阳性反应呈蓝紫色。

2.2 ACP ACP作用液成分为0.2mol/L醋酸缓冲液(p H 4.7)、5%Pb(NO3)2、3.2%β-甘油磷酸钠。37℃条件下,将组织切片浸于作用液中孵育2h。蒸馏水浸洗数次,再浸入1%(N H4)2S溶液作用2-3min。蒸馏水浸洗后苏木精复染。阳性反应呈棕色或棕黑色。

2.3 ATP酶 ATP酶作用液成分为三磷酸腺苷钠盐、0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(p H 7.2)、2%Pb(NO3)2、0.1mol/L MgSO4混合后取得的上清液,将组织切片浸于作用液中孵育1-3h,蒸馏水浸洗3次,在1%硫化铵中浸1min,蒸馏水洗净。阳性反应呈棕黄色。

2.4 酯酶 酯酶作用液成分为α-醋酸萘酯、PBS、Schiff’s试剂。将组织切片浸于作用液中孵育1h,流水冲洗,苏木精复染,蒸馏水洗净。阳性反应呈红棕色。

2.5 脂酶 脂酶作用液成分为0.5mol/L Tris缓冲液(p H 7.2-7.4)、10%CaCl2、5%Tween-80。将组织切片置于作用液中孵育3-12 h,蒸馏水浸洗3次,浸入1%Pb(NO3)2溶液中15min,再在1-2%(N H4)2S中浸1-2min,苏木精复染,蒸馏水洗净。阳性反应部位出现棕黑色沉淀颗粒。

3.光 密度测定与数据统计分析

在Olympus BX61型显微镜下观察拍照,采用Image-Pro Plus图像分析软件对染色阳性部位进行光密度分析,测出切片中阳性部位的累积光密度(integrated optical density,IOD)和面积,算出平均光密度(mean optical density,MOD)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性比较,P<0.05为差异显著。

结 果

光镜下,消化酶的分布部位呈现明显的组织化学染色反应,经光密度定量分析后,牛蛙消化道黏膜ALP、ACP、ATP酶、酯酶和脂酶等5种酶的分布见表1。

表1 牛蛙消化道黏膜5种酶的分布Table 1 Distribution of five types of enzymes in the gastrointestinal mucosa ofRana catesbeinana

1.A LP

ALP阳性部位呈蓝紫色(图1)。十二指肠、空肠和回肠酶活力显著较高(P<0.01),是ALP的主要分布部位;食道和直肠其次,贲门、胃体和幽门呈弱阳性,酶活力显著较低(P<0.01)。ALP主要位于消化道黏膜上皮层,集中于肠上皮细胞顶部的纹状缘。

2.A CP

ACP阳性部位呈棕黑色(图2)。贲门、胃体和幽门酶活力显著较高(P<0.01),是ACP的主要分布部位;食道和肠道各段呈弱阳性,酶活力显著较低(P<0.01)。ACP主要位于胃黏膜上皮层细胞内。

3.A TP酶

A TP酶阳性部位呈棕黄色(图3,4)。消化道各段均显示出较高的A TP酶活力。在十二指肠、空肠和回肠酶活力显著较高(P<0.01),贲门、胃体和幽门其次,食道和直肠酶活力显著较低(P<0.05)。ATP酶主要位于消化道的肌层和上皮细胞层,胃腺上皮亦有较多分布。

4.酯 酶

酯酶阳性部位呈红棕色(图5)。十二指肠、回肠和直肠酶活力显著较高(P<0.01),贲门、胃体、幽门和空肠其次,食道酶活力显著较低(P<0.05)。酯酶位于消化道黏膜上皮细胞顶部。

5.脂 酶

脂酶的阳性部位具棕黑色沉淀颗粒(图6)。十二指肠、空肠和回肠酶活力显著较高(P<0.01),胃体、幽门部和直肠其次,食道和贲门酶活力显著较低(P<0.05)。脂酶主要位于消化道黏膜上皮细胞层和消化腔内。

讨 论

消化酶的分布是反映动物消化道不同部位消化吸收机能的一项重要指标。目前,对低等脊椎动物消化道黏膜消化酶分布的研究主要集中在经济养殖型鱼类[4-8],蛙类的研究报道较少。本研究应用酶的组织化学方法对牛蛙消化道黏膜5种重要消化酶的分布进行了研究。

ALP是一种在动物体内广泛存在的非特异性磷酸水解酶,鱼类消化道ALP主要分布于肠道各段[4-8],本研究显示牛蛙消化道ALP主要分布于十二指肠、空肠和回肠,与鱼类基本一致。ALP不仅与有机磷的代谢、蛋白质及脂类的代谢有关,还参与主动运输和吸收过程[9,10],是营养物质吸收的标志酶[7]。牛蛙消化道ALP活性集中于肠上皮细胞顶部纹状缘处,与其参与肠上皮细胞的吸收功能相一致。ALP的分布表明十二指肠、空肠和回肠是牛蛙消化道主要吸收部位。

ACP是一种广泛分布于生物界的磷酸酯酶,常存在于细胞的溶酶体内。鱼类ACP在胃和肠道各段均有分布[4-8],褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)[4]和许氏平鲉(Sebastes schlegeli)[5]肠道ACP的活性明显高于胃,本研究则显示牛蛙消化道ACP主要分布于胃,肠道各段ACP活力很低。ACP需在酸性条件下发挥作用,牛蛙消化道ACP的分布与鱼类不同可能与牛蛙消化道各段的分化程度较鱼类高有关。ACP是溶酶体的标志酶,主要参与细胞内消化作用[4,5],牛蛙胃上皮具有较强的ACP活力,显示其具有一定的细胞内消化功能。

ATP酶是位于细胞膜上的一种糖蛋白,主要参与维持细胞膜内外的离子梯度差,参与肠上皮细胞对营养物质的吸收作用[11,12]。牛蛙消化道A TP酶主要分布于十二指肠、空肠和回肠进一步表明其是牛蛙消化道主要吸收部位。有报道认为ATP酶还介导了蛙类胃蛋白酶和胃酸的分泌[12],本研究发现牛蛙胃腺上皮细胞中有较高的ATP酶活力,从形态学上支持了上述结果。

酯酶和脂酶分别参与酯类和脂类的消化作用。酯酶在不同鱼类消化道分布差异较大,褐菖鲉消化道酯酶主要分布于胃,食道和肠道仅有微弱的酯酶活性[4],许氏平鲉[5]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[6]酯酶则主要分布于肠道,欧洲无须鳕(Merluccius merluccius)[7]酯酶在消化道各段均有分布,肠道中酯酶活性明显较高。鱼类的脂酶主要分布于胃和肠道[6,8]。本研究发现牛蛙的酯酶和脂酶均在消化道各段都有分布,且均以肠道酶活性显著较高,与朱联九等[2]的生化分析测定结果相一致,进一步显示肠道是牛蛙对脂质的主要消化部位。

综上所述,牛蛙消化道黏膜酶的分布同其它物种有相似之处,也有其自身特点。十二指肠、空肠和回肠是牛蛙的主要消化吸收部位。

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图 版 说 明

图1 十二指肠碱性磷酸酶,位于肠上皮细胞顶部的纹状缘;

图2 胃体酸性磷酸酶,位于胃黏膜上皮细胞内;

图3 胃幽门ATP酶,位于胃腺上皮细胞;

图4十二指肠ATP酶,位于肌层和上皮细胞;

图5十二指肠酯酶,位于上皮细胞顶部;

图6十二指肠脂酶,位于黏膜上皮细胞层和消化腔内。Ep:上皮 ;GG:胃腺;ML:肌层;标尺 =100μm

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 ALP in duodenum,localized in the brush border of epithelial cells

Fig.2 ACP in stomachus corpus,localized in the epithelial cells of gastric mucosa

Fig.3 ATPase in stomachus pyloricus,localized in the epithelial cells of gastric glands

Fig.4 ATPase in duodenum,localized in the muscular layer and the epithelial cells of mucosa

Fig.5 Eterase in duodenum,localized in the apical portions of the epithelial cells

Fig.6 Lipase in duodenum,localized in the epithelial cells and the digestive cavity. Ep:epithelium;GG:gastric gland;ML:muscular layer;Scale bar=100μm