罗格列酮对大鼠肺纤维化细胞模型干预治疗的疗效观察

喻昌利 李林 戈艳蕾 王红阳

罗格列酮对大鼠肺纤维化细胞模型干预治疗的疗效观察

喻昌利 李林 戈艳蕾 王红阳

目的采用转化生长因子(TGF-β1)诱导大鼠肺成纤维细胞，给予罗格列酮干预，明确其对大鼠肺纤维化的影响。方法 以组织贴块法培养肺成纤维细胞，分为0.4%血清对照组(空白对照组)、TGF-β1模型组(模型组)、TGF-β1+不同浓度罗格列酮干预组(干预组)，分别检测大鼠肺纤维化细胞代谢活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成情况。结果 不同浓度罗格列酮干预组OD值与模型组比较都有所下降(P＜0.05)，其中罗格列酮浓度在10 μmol/L时OD值与模型组比较下降最为明显，不同罗格列酮浓度组间OD值差异无显著性(P＞0.05)。10 μmol/L罗格列酮干预组与模型组相比较，Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达下降，差异具有显著性(P＜0.05)。结论 罗格列酮可以抑制TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖和Ⅰ型、Ⅲ型胶原的合成。

肺纤维化;罗格列酮;过氧化物体增殖活化受体-γ;TGF-β1;大鼠;疗效

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 出生1～2 d的Wistar大鼠(由河北联合大学实验动物中心提供)20只;小鼠抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型胶原单克隆抗体(Sigma产品);羊抗小鼠二抗、DAB显色试剂盒(博士德生物有限公司);转化生长因子(TGF-β1)(peprotech产品);马来酸罗格列酮(葛兰素史克，购自医药公司)。

1.2 方法 取出Wistar乳鼠肺组织，将肺组织剪碎成1 mm3大小，接种于培养瓶中，将培养的细胞调整同步化后，使细胞静止于G0/G1期，取第四代细胞接种于培养板，分为3组:(1)空白对照组:以0.4%血清浓度DMEM为基础培养液，培养大鼠肺成纤维细胞。(2)模型组:0.4%血清培养条件下，给予TGF-β1(5 ng/ml)孵育细胞。(3)干预组:0.4%血清培养条件下，分别同时给予不同浓度罗格列酮(10、20、50、100 μmol/L)，预孵育30 min后给予TGF-β1(5 ng/ml)孵育细胞。按照以上实验分组分别加入相应试剂，刺激48 h后，MTT法检测细胞代谢活性及免疫细胞化学常规染色方法检测Ⅰ型与Ⅲ型胶原，经自动图像分析系统进行半定量分析。

1.3统计学分析应用SPSS 14.0统计软件，计量资料以±s

表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺成纤维细胞的形态学特征 显微镜下观察大鼠肺成纤维细胞呈梭形，胞质透明，胞核较大，可见核仁。细胞伸出多个突起，并连接成网状，在局部融合成片，细胞密集时呈放射状分布，TGF-β1诱导的大鼠肺纤维化细胞模型建立成功。

2.2 罗格列酮对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖的调节作用 干预组随着罗格列酮剂量(10、20、50、100 μmol/L)的增加，反映细胞代谢活性的OD值分别是模型组的80.6%，85.1%，87.2%，89.8%和94.9%，与模型组比较均有所下降，不同罗格列酮浓度组与模型组间差异有统计学意义(P＜0.05)，其中当罗格列酮浓度在10 μmol/L时干预组OD值与模型组比较下降最为明显，但不同罗格列酮浓度组间OD值差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 罗格列酮对大鼠肺成纤维细胞增殖抑制的剂量关系

2.3 免疫细胞化学法测定肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达情况 当罗格列酮浓度在10 μmol/L时反映细胞代谢活性OD值与模型组比较下降最为明显，选择罗格列酮浓度10 μmol/L进行干预，与模型组相比较，Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 3组大鼠肺纤维化细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况

3 讨论

肺纤维化是在各种病因下导致的肺间质纤维增生。有研究发现TGF-β1可以调控细胞的增生、分化、凋亡、黏附、运动以及产生某些促纤维化细胞因子［3］，是目前最强的促进肺成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质的刺激因子，在肺纤维化疾病发病过程中发挥重要作用［4］。

目前肺间质纤维化尚无有效药物治疗。研究发现PPAR-γ通过连接到目标基因增强子序列上的过氧化物体增殖反应元件，可以调节生殖、代谢、生长和免疫反应的基因表达［5，6］。有研究发现对肺纤维化大鼠模型应用PPARγ激动剂治疗，可以使肺纤维化缓解，提示PPARγ激动剂对肺纤维存在一定治疗作用［7］。

本研究发现MTT法检测干预组OD值较模型组降低，提示罗格列酮干预对大鼠肺成纤维细胞增殖有抑制作用，其中当罗格列酮浓度在10 μmol/L时，干预组OD值与模型组比较下降最为明显，但不同罗格列酮浓度组间OD值差异无统计学意义(P＞0.05)。同时在检测大鼠肺成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达发现，予罗格列酮干预后，Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达量下降，显示罗格列酮能够抑制TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达，在一定程度上提示罗格列酮有拮抗肺纤维化的作用。表明罗格列酮对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖有抑制作用，这为肺间质纤维化的防治提供了新的思路。

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3 Necela BM，Su W，Thompson EA.Toll-like receptor 4 mediates cross-talk between PPARγ and NF-kappaB in macrophages.Immunology，2008，125:344-358.

4 Reddy RC.Immunomodulatory role of PPARγ in alveolar macrophages.Investig Med，2008，562:522-527.

5 梁鸣，李雯，顾海峪.罗格列酮对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的影响.广东医学，2007，28:195-196.

6 Madtesdk A，Elstonal S，Hachmanrl J，et al.Transforming growth factoralpha deficiency reduced pulmonary fibrosis in transgenic mice.Am J Res pir Cell Mol Biol，1999，20:924-934.

7 李晶，李忠，莫宝庆.ERK5 MAPK信号转导通路研究进展.医学分子生物学杂志，2005，2:288-291.

Therapeutic effect of rosiglitazone on the models of rat pulmonary fibrosis cell

YU Changli，LI Lin，GE Yanlei，et al．Department of Respiratory Medicine，Hebei United University，Hebei，Tangshan 063000，China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of rosiglitazone on the models of rat pulmonary fibrosis cell by inducing rat lung fibroblast with transforming growth factor(TGF-β1)，then giving rosiglitazone intervention therapy.MethodsThe lung fibroblasts were cultured with tissue paste-block method，which were divided into 0.4%serum control group(blank control group)，TGF-β1 model group(model group)，TGF-β1+different concentration rosiglitazone treatment groups(intervention group)，and immunohistochemical staining was used to detect the metabolic activity of pulmonary fibrosis cell and the synthesis condition of typeⅠ，Ⅲ collagen.ResultsCompared with the model group，different concentrations of rosiglitazone groups’OD values declined(P＜0.05)，and 10μmol/L rosiglitazone group had the most obvious result，different concentration of rosiglitazone was no significant difference in OD values(P ＞0.05).10 mol/L rosiglitazone group decreased typeⅠandⅢcollagen expression(P＜0.05).ConclusionRosiglitazone can inhibit the proliferation of rat lung fibroblast induced by TGF-β1 and can inhibit the synthesis of typeⅠ，Ⅲ collagen.

pulmonary fibrosis;rosiglitazone;PPAR-γ;TGF-β1;rats;effect近年来研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ激动剂——罗格列酮，可以通过负反馈调节T细胞、巨噬细胞及有关免疫调节细胞的活化、增生及炎性反应基因的转录，从而具有抗纤维化作用［1］。目前其抗纤维化作用的研究主要集中在肝脏、心脏和肾间质［2，3］，对抗肺间质纤维化的研究较少。本实验探讨罗格列酮对肺间质是否存在抗纤维化作用，为肺间质纤维化的防治提供新思路。

R 563

A

1002-7386(2011)09-1299-02

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．006

063000 河北省唐山市，河北联合大学附属医院呼吸内科

2011-01-06)

·论著·