一株抑制浒苔生长海洋细菌的分离与鉴定

汪靖超,辛宜轩

(1.青岛大学 生物系,山东 青岛 266071; 2.青岛第二中学,山东 青岛 266061)

浒苔(Enteromopha prolifera(Müller) J.Ag.)是一种大型经济海藻,属绿藻门、石莼目、石莼科、浒苔属,广泛分布于河口、近海滩涂,自然繁殖能力和环境适应能力特别强。适度的浒苔生长会消耗水体中的营养盐和浮游生物,在一定程度上能降低赤潮的发生几率,但浒苔等绿藻的瞬间大量爆发则会形成绿潮。绿潮现在已成为全世界范围的富营养化难题,法国Brittany海区绿藻大规模爆发,每年打捞的绿藻可达85 000m3,日本从20世纪70年代起每年均有绿潮爆发,横滨市每年花费在打捞绿藻上的费用可达4 000万日元[1-3]。2007年7月和2008年6月,青岛近海海域发生了大规模浒苔漂浮现象,政府和民间动员大量人力物力,两年分别打捞出 7000多吨和100多万吨浒苔[4-5]。

溶藻细菌(Algae-1ysing bacterium)能够通过直接或间接方式,抑制藻类生长或杀死藻类,从而溶解藻细胞。在利用物理、化学以及其他方法治理水华都不太理想的情况下,溶藻细菌的使用已经引起越来越多学者的关注[6-7]。作者从青岛海域的海泥中分离纯化了一株可抑制浒苔生长的海洋细菌 EP23,并对该菌株进行了鉴定,以期为浒苔的生物防治研究提供理论根据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

浒苔采自青岛第一海水浴场,海泥取自青岛大麦岛,实验用海水取自青岛奥帆赛场。16S rDNA引物合成、DNA序列分析由上海生工生物工程技术有限公司完成,克隆所需工具酶购自大连宝生物工程公司,其他试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

实验用牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基均用陈海水配制。

1.3 实验方法

1.3.1 浒苔培养

接种浒苔于无菌海水中,光照培养箱中培养。培养温度为 20℃,光照强度为 60 μmol/(m2.s),光: 暗为12 h:12 h,每天摇动培养瓶3次。

1.3.2 溶藻细菌的分离

称取10 g海泥,放入盛有90 mL无菌海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振荡30 min。悬液稀释后涂布牛肉膏蛋白胨培养基,28℃培养48 h,对培养出的众多细菌再划线分离纯化,获得单个菌落。

1.3.3 溶藻细菌对浒苔抑制活性的测定

分别挑取分离的各菌落于2 mL LB培养液中,28℃振荡培养24 h,10 000r/min离心5 min,取上清,按照 1 : 100的比例(V/V)加入浒苔培养液中,混匀,20℃继续培养3 d,观察浒苔变化。

1.3.4 菌种鉴定

1.3.4.1 菌体形态学观察

牛肉膏蛋白胨平板划线培养待鉴定菌株,28 ℃恒温培养1~3 d,进行形态学、革兰氏染色、鞭毛染色和芽孢染色观察,具体方法参照文献[8]进行。

1.3.4.2 生理生化特征的测定

参照文献[8]介绍的方法进行。

1.3.4.3 基因组DNA的提取和16S rDNA的扩增

参照文献[9-10]的方法进行 DNA的提取、引物设计及PCR扩增。

1.3.4.4 克隆载体的构建、测序及分子生物学鉴定

回收PCR产物,连接到pMD-18T Simple载体,转化E.coliDH5α,碱法提取质粒,酶切后进行电泳分析并测序。将测序结果用NCBI的Blast程序进行序列同源性比对。

2 结果

2.1 细菌的分离

从实验海泥中分离得到了特征明显的57株细菌,测定各菌株对浒苔的毒性,有8株菌株对浒苔有抑制作用,其中毒性最强的为第23号菌株,该菌株编号为EP23。

2.2 菌株EP23的形态特征

EP23菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上 28℃培养24 h后,形成的菌落圆形、扁平、灰白色、不透明、黏稠、大小中等、表面不光滑、边缘不规则。草酸铵结晶紫常规染色,光镜下观察该菌为杆状,单生、双生或多个细胞连接成链状,菌体大小为 0.7~0.8 μm×2.5~3.5 μm。悬滴法观察EP23菌株具有很强的运动性,硝酸银鞭毛染色观察到细胞有周生鞭毛;Schaeffer-Fulton氏染色法观察到大量菌体内有芽孢,未见伴孢晶体,芽孢中生,椭圆形,芽孢囊不膨大;革兰氏染色阳性。

2.3 生理生化特征

EP23菌株的生理生化特征见表1。

表1 EP23菌株的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain EP23

综合该菌株的菌落形态、个体特征及其生理生化反应特性,参照文献[11-12],将 EP23菌株初步鉴定为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。

2.4 16S rDNA序列分析

由PCR扩增产物电泳图(图1)可见,扩增得到目的片段长约 1.5 kb左右,与 16S rRNA序列长度一致。将扩增的16S rDNA序列克隆后测序得到1451 bp长度的序列,该序列在 GenBank中的登录号为GQ279347。将该序列与 GeneBank库中已有的细菌16S rDNA序列进行BLAST比较后,发现该菌株与弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexusstrain KSC_SF9c)16S rDNA同源性高达99.7%,结合细菌的常规鉴定结果,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

2.5 EP23对浒苔的毒性

EP23菌株经过液体培养后,经过高速离心去除绝大部分菌体,上清液按体积1 : 100的比例,加入浒苔的培养液,3 d后藻体开始变黄,5 d后浒苔全部死亡,叶绿素分解,说明 EP23的胞外产物对浒苔具有明显的毒性。

图1 EP23菌株基因组DNA的提取与16S rDNA的扩增Fig.1 Genomic DNA and 16S rDNA of strain EP23

3 讨论

目前对于浒苔的爆发,除了动用人力打捞之外,缺少有效的控制方法。雷清新等[13]研究了铜离子对缘管浒苔(E.linza)的毒性,结果显示0.5 mg/L的Cu2+可使缘管浒苔迅速死亡。孙修涛等[14]研究了盐度、温度、黑暗、酸度等4个理化环境因子以及生石灰、硫酸铜、含氯消毒剂、7种除草剂对浒苔生长的影响,结果显示浒苔是一种具有极强抗逆能力的海洋植物,各种试验用药物均需要较高的浓度才会对浒苔有毒性,而药物的大量使用又会对海洋环境造成新的污染。

利用溶藻细菌控制水华的研究在国外已有数十年历史,近年来,不少国外研究者认为: 水华和赤潮的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关[7]。国内外陆续报道了多种具有溶藻活性的细菌,Reim[15]曾报道了一株杆菌属细菌对蓝藻有溶藻活性,该细菌通过分泌胞外物质杀死蓝藻细胞。细菌的溶藻方式一般有两种: 一是直接溶藻,也就是直接进攻藻细胞,它需要菌体与藻细胞直接接触,甚至侵入藻细胞内部;二是间接溶藻,主要包括细菌同藻类争夺营养或细菌分泌胞外物质溶藻[6]。本文分离到的弯曲芽孢杆菌EP23,其培养液高速离心后,上清液对浒苔具有明显毒性,表明弯曲芽孢杆菌EP23是通过分泌胞外物质的间接方式进行溶藻的,作者也将对该菌分泌的毒素性质及其抑制浒苔生长的机理作深入的研究。

弯曲芽孢杆菌EP23的实际应用,还有几个问题需要加以解决,首先,虽然该菌本身就是从海泥中分离而来,也未见弯曲芽孢杆菌是鱼、虾、贝等海洋生物致病菌的报道,但该菌对于广大海洋生物是否存在毒性,施用后能否造成二次污染,还需要进行广泛深入的研究; 同时,浒苔大爆发根本原因是水体的富营养化,而细菌溶藻后水体中大量的氮、磷并未被去除,富营养化问题仍然存在,利用细菌进行溶藻,虽然可在表面上消除浒苔爆发形成的绿潮,并不能从根本上解决水华问题,彻底解决浒苔大爆发的问题还应该以预防为主,减少对海水的污染,控制海水的富营养化。

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