儿童耳聋家庭GJB2、SLC26A4和m tDNA基因型检测及产前咨询*

周 艾,方如平,戴 朴,李 琦

1)南京医科大学附属南京儿童医院耳鼻咽喉-头颈外科 南京 210008 2)中国人民解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科 南京100853 3)南京医科大学附属南京儿童医院儿童听力中心南京 210008

#通讯作者,男,1971年5月生,博士,副主任医师,研究方向:儿童听力学、耳聋基因诊断及耳鼻咽喉-头颈外科临床,E-mail: liqi71520@sina.com

随着耳聋基因诊断技术的进步,耳聋相关基因检测已经广泛使用,并应用于耳聋的早期干预,研究表明[1],GJB2、SLC26A4和线粒体基因(m tDNA)的病理性突变导致了大部分的非综合征性遗传性耳聋。利用基因诊断技术对上述 3个基因检测,可在约 70%的遗传性耳聋患者中发现致聋基因突变[2-5]。检测携带者能够为其提供产前咨询,继而进一步产前诊断,从而避免再次孕产耳聋儿。现将南京医科大学附属南京儿童医院以生育为目的的儿童听力障碍遗传学检测结果分析报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 南京儿童医院儿童听力中心听力门诊就诊的已经育有一个耳聋患儿的家庭,有生育第二胎的强烈愿望。共 13个家庭纳入该项研究,父母听力正常,家族中无其他遗传性疾病史。先证者行ABR或纯音测听(行为测听)检查,听力损失为中度至极重度耳聋,其中语前聋 9例,语后聋 4例,年龄6个月～8岁。颞骨薄层 CT发现大前庭水管综合征(enlarged vestibular aqueduct syndrome, EVAS)2例。

1.2 患儿GJB 2、SLC26A4及m tDNA 1494、1555位点突变筛查

1.2.1 DNA制备 收集先证者及父母的外周静脉血样本,应用试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取血液基因组DNA,紫外分光光度计进行定量和纯度检测,保存于 -20℃冰箱备用。

1.2.2 GJB2基因的PCR检测 GJB2上游引物序列5'-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3',下游引物序列5'-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3',扩增产物大小为944 bp。引物由南京金斯特生物技术公司合成。PCR反应体系:100 ng的基因组DNA,10×Buffer(含MgCl215mmol/L)缓冲液5μL,10×dNTP(15 mmol/ L)5μL,2 nmol/L上、下游引物各2.5μL,Taq酶(北京泰格美科技有限公司)1μL,加双蒸水至 50μL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30 s,58℃复性30 s,72℃延伸 30 s,30个循环;72℃延伸5 min。PCR产物4℃保存。取4μL产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶0.5mg/L)检测。

1.2.3 SLC26A4基因第7、8外显子以及第7内含子全部序列的PCR检测 上游引物序列5'-CATG GTTTTTCATGTGGGAAGATTC-3',下游引物序列5'-AGACTGACTTACTGACTTAATGT-3',扩增产物大小为502 bp。引物由南京金斯特生物技术公司合成。PCR反应条件退火温度55℃,其他同GJB2基因。SLC26A4基因其他外显子反应条件和体系参考文献[6]。

1.2.4 mtDNA 12S rRNA1494和1555位点检测上游引物序列5'-CGCCATCTTCAGCAAACCCT-3',下游引物序列5'-TGCGCCAGGTTTCAATTTCTATC-3',扩增产物大小为 468 bp。引物由南京金斯特生物技术公司合成。PCR反应条件同GJB2基因。

1.3 结果判定 对DNA进行Big-Dye测序(美国ABI 3730-Avant Genetic Analyzer测序仪,由南京金斯特生物技术有限公司完成),测序结果采用Gene-Tool Lite 1.0软件进行比对分析。将GJB2基因和NCBI网站的人类GJB2基因标准序列(ACCESSION:AY280971,VERSION:AY280971.1,GI: 33391196)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/～nucleotide＆val=33391196)进行比对,mtDNA与人类线粒体标准序列(经过校正的人类m tDNA剑桥参考序列,Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence,Last updated 2008-06-13)进行比对,SLC26A4基因同GenBank序列(ACCESSION:NT_007933,VERSION:NT_007933.14 GI: 51493052)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 51493052)进行比对,发现可疑的突变位点后用Chromas 1.62软件读取测序结果的峰图文件,进行确认或排除。

2 结果

耳聋家庭相关基因检测结果、遗传模式及再生育耳聋儿风险见表1和图1、2。GJB2基因突变4例其中235delC纯合突变1例,235delC/299delAT 1例,95G→A(R32H)/235delC 1例,235delC杂合突变1例;SLC26A4基因IVS7-2A→G纯合突变1例, IVS7-2A→G/H723R 1例,均为EVAS患者;mtDNA A1555G突变 1例;未发现突变者 6例。

3 讨论

随着基因组学的迅速发展,遗传咨询也有了新的涵义。根据美国国家遗传学协会的定义:遗传咨询是帮助人们理解和适应与疾病相关的遗传因素对医学、心理和家庭影响的过程,其内容包括:解释家族史和疾病史,评估疾病的发生或再发的风险,进行疾病相关遗传、检测、治疗、预防及目前研究的教育,遗传咨询以使患者及/或亲属了解知情选择权以及对于疾病风险的接受[7]。耳聋基因诊断产前咨询的作用包括:患儿发生遗传性耳聋的可能性;处于遗传风险家庭的发现以及家庭对于遗传学检测的选择;遗传模式和再发的风险。

该组患儿均为隐性遗传性耳聋,没有家族史,家庭中只有一个聋儿,迫切地希望了解孩子耳聋的原因以及下一个孩子发生耳聋的几率。作者选择检测GJB2全序列、SLC26A4全序列和mtDNA 12S rRNA基因 1494和 1555位点,其突变在遗传性耳聋中占有较高比例,并且可以在短期内完成检测,从而为耳聋的基因诊断和遗传咨询提供了良好的机会[8-10]。

13个家庭中与GJB2基因相关者4个,GJB2基因突变是儿童感音神经性耳聋的主要原因,尽管GJB2单杂合突变不能完全解释耳聋原因,但仍支持遗传因素参与发病[11]。SLC26A4基因共21个外显子,但SLC26A4基因外显子7和外显子8的IVS7-2 A→G突变是中国汉族人群的主要突变,占所有SLC26A 4突变的 63.5%,65.7%的患者携带此突变[12-13]。该研究发现SLC26A 4 IVS7-2A→G纯合突变和复合突变2例,颞骨CT检查均为EVAS,提示对于SLC26A4基因的耳聋,颞骨CT扫描必不可少,对于EVAS患儿有针对性的检测可以大大提高检测效率,阳性者行SLC26A 4基因全序列检测,阴性者可仅行SLC26A4IVS7-2A→G突变检测。mtDNA A1555G突变与氨基糖甙类药物诱发的耳聋密切相关,发生率相对较前两者低,该研究中发现 1例。线粒体COI基因7445位点和药物性耳聋的关系尚有争议,该研究未做检测[14]。

产前咨询其目的是提供信息和帮助家庭做出选择,为新生儿今后的健康与教育提供指导。对于检查阳性结果的家庭,必须解释再生育的风险,产前诊断可以在父母同意的情况下进行。先证者与父母的基因检测给了父母选择的机会,采取避孕或产前诊断的方法终止妊娠。

总之,产前咨询着重关注父母需要、伦理道德方面、法律的、职业的、经济上的考虑,使患儿父母有权知道耳聋基因诊断的益处和潜在的风险,但不能过度夸大耳聋基因诊断的作用,以免使父母产生不恰当的期望。

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