响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件

陈 琳，孟祥晨

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件

陈 琳，孟祥晨*

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

为提高一株分离自内蒙古传统发酵稀奶油“焦克”中的植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素量，以中性蛋白酶水解脱脂乳为培养基，以枯草芽孢杆菌为指示菌，以抑菌圈直径为考察指标，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化发酵pH值、温度以及接种量。结果表明：对该菌代谢产细菌素的活性影响大小依次为：发酵pH值＞接种量＞发酵温度；最优发酵条件为：pH5.1、发酵温度33℃、接种量1%。在此条件下，发酵液的抑菌圈直径为15.00mm，细菌素的效价为601.32IU/mL，较优化前提高了43.08%。在最优发酵条件下获得的实验结果与模型预测值吻合，说明所建立的模型是切实可行的。

响应面；细菌素；植物乳杆菌；焦克

“焦克”是内蒙古的一种传统发酵稀奶油产品，属于自然发酵乳制品，保质期较长，其中蕴含丰富的乳酸菌资源。乳酸菌发酵乳糖产酸形成低pH值是其能够较长时间保藏的主要原因，其次，乳酸菌代谢产生的具有抑菌活性的物质，如细菌素，也有利于这种产品的保藏[1]。在前期研究中笔者分析了从“焦克”中分离的67株乳酸菌产抑菌物质的能力，发现4株乳杆菌具有较强的产抑菌物质的能力，经排除干扰因素后确定主要的抑菌物质为细菌素。其中，植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产生的植物乳杆菌素MG不仅可以抑制单细胞增生利斯特氏菌等革兰氏阳性细菌，还可抑制沙门氏菌等革兰氏阴性细菌，该细菌素是具有良好热、酸稳定性的蛋白质性物质[2]，在食品中有良好的应用前景。

乳酸菌代谢产生细菌素的能力和产量，除了受菌株自身特性的影响，还受发酵条件的影响，如培养基、发酵pH值[3]、发酵温度[4]以及接种量[5]等。本研究以分离自“焦克”的植物乳杆菌KLDS1.0391为研究对象，以前期优化的酶水解脱脂乳为培养基，通过单因素试验和响应面法优化发酵条件，获得该菌代谢产生细菌素的最优发酵参数，为该细菌素的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KLDS1.0391分离自内蒙古自治区传统发酵稀奶油，由乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心冻干保藏。指示菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633购自中国药品生物制品检定所。

MRS培养基 英国Oxoid公司；营养肉汤培养基北京奥博星生物技术有限责任公司。

脱脂乳(蛋白质含量为35%) 新西兰Karicare公司；中性蛋白酶(酶活力为0.8AU/g) 北京诺维信公司；乳链球菌素Nisin(含Nisin 2.5%) 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KLF2000 3.7L发酵罐 瑞士比欧生物工程公司；SPX-150B生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；ES-2030冷冻干燥机 日本日立公司；HVE-50型高压灭菌器 日本Hirayama公司；BCN1360型生物洁净工作台 上海佳胜实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化与培养

植物乳杆菌KLDS1.0391经活化传代恢复活力后，以1%接种量接入MRS培养基中，37℃静置培养24h。

枯草芽孢杆菌ATCC6633经活化传代恢复活力后，以0.3%接种量接种到营养肉汤培养基中，37℃摇床培养18h。

1.3.2 发酵液抑菌活性的测定

无细胞发酵上清液的制备：取发酵液于4℃、12000×g离心15min，收集上清液，用6mol/L NaOH调pH6.5，以中和有机酸的干扰，经0.22μm滤膜过滤，除去菌体及其他杂质，然后冷冻干燥，冻干后取1g冻干样品加入1mL灭菌双蒸水，溶解后放入-20℃冰箱中备用。

采用双层平板打孔法测定抑菌活性[6]。配制质量浓度1.2g/100mL琼脂，灭菌后按每平皿10mL倾倒平板，备用。制备含质量浓度0.7g/100mL琼脂的100mL肉汤培养基，灭菌后冷却至 50℃左右，接入0.6mL枯草芽孢杆菌培养液，混匀后立即取6mL倒入含有琼脂的平皿上，冷却后，用打孔器打孔，孔直径为6 m m。在孔中加入50μL无细胞发酵上清液，在超净工作台上放置3h后，于30℃静置培养24h，取出平皿后用游标卡尺测量抑菌圈直径(不含孔径)。

细菌素效价的测定：根据Cabo等[7]的方法绘制标准效价曲线，以枯草芽孢杆菌ATCC6633为指示菌，以Nisin为阳性对照。将上述获得的抑菌圈直径代入效价回归方程，计算发酵液中细菌素的效价。本实验测得回归方程为y=0.2425x+0.6111，y表示效价的对数值；x表示抑菌圈直径(不含孔径，单位为mm)，R2=0.9868。

1.3.3 酶水解脱脂乳培养基的制备

配制质量浓度4g/100mL的脱脂乳溶液2L，调pH7.0，水浴中升温至50℃，添加0.05g/100mL的中性蛋白酶，恒温水解，水解过程中加入2mol/L的氢氧化钠维持pH 7.0。根据pH-stat方法[8]制备成水解度为15%的脱脂乳溶液，然后添加质量浓度2g/100mL葡萄糖和0.1g/100mL吐温-80制成用于发酵的酶水解脱脂乳培养基。

1.3.4 单因素试验

按照1.3.3节方法制备酶水解脱脂乳培养基，装入3.7L发酵罐中，装罐量为2L，115℃灭菌15min。选择发酵pH值、发酵温度、接种量作为影响抑菌活性的主要因素，通过单因素试验选取响应面试验的因素和水平。

1.3.4.1 发酵pH值对植物乳杆菌代谢产细菌素的影响

以1%接种量接种植物乳杆菌KLDS1.0391培养液，发酵pH值分别设为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，发酵温度30℃，发酵时间24h。发酵结束后，放罐、取样，按照1.3.2节所述方法测定发酵液的抑菌圈直径。

1.3.4.2 接种量对植物乳杆菌代谢产细菌素的影响

分别以1%、2%、3%、4%的接种量接种植物乳杆菌KLDS1.0391培养液，发酵pH值为5.0，发酵温度30℃，发酵时间24h。发酵结束后，放罐、取样，按照1.3.2节所述方法测定发酵液的抑菌圈直径。

1.3.4.3 发酵温度对植物乳杆菌代谢产细菌素的影响

以1%接种量接种植物乳杆菌KLDS1.0391培养液，发酵pH值为5.0，发酵温度分别设为30、35、40℃，发酵时间24h。发酵结束后，放罐、取样，按照1.3.2节所述方法测定发酵液的抑菌圈直径。

1.3.5 响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件

根据单因素试验结果，选取发酵pH值(X1)、发酵温度(X2)和接种量(X3)3个因素为自变量，以抑菌圈直径为响应值，进行中心组合试验设计[9]。每个试验重复3次，取其平均值，试验因素水平及编码见表1。

表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors, levels and codes of response surface tests

1.3.6 模型的验证

通过响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件。在优化条件下进行发酵实验，通过比较预测值和实验值验证模型的有效性。

1.3.7 数据处理与分析

每个试验重复3次，取其平均值。采用SAS 8.1及Microsoft Excel 2003统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，采用Design Expert 7.1 软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵pH值对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的影响

图1 发酵pH值对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的影响Fig.1 Effect of fermentation pH on bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

如图1所示，发酵pH值对植物乳杆菌发酵产细菌素的影响显著(P＜0.05)。当发酵pH值在4.5～5.0范围内，菌株代谢产生细菌素的抑菌活性迅速增加，当发酵pH值为5.0时抑菌圈直径达到最大，随发酵pH值继续增加，抑菌活性呈逐渐下降趋势。根据抑菌圈直径，选择发酵pH5.0为响应面试验中心试验点。

2.1.2 接种量对植物乳杆菌KLDS1.0391发酵产细菌素的影响

图2 接种量对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

接种量的大小影响乳杆菌的生长周期，接种量对该菌代谢产细菌素的影响如图2所示。抑菌活性随接种量增加而逐渐下降，接种量对该菌产细菌素的影响显著(P＜0.05)。根据抑菌圈直径，选择接种量为1%进行响应面试验。

2.1.3 发酵温度对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的影响

图3 发酵温度对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

发酵温度影响菌体的生长和细菌素的合成。如图3所示，发酵温度为30℃时，抑菌活性最高，抑菌活性随发酵温度的升高呈逐渐下降趋势，但差异不显著(P＞0.05)。根据抑菌圈直径，选择发酵温度为30℃进行响应面试验。

2.2 响应面模型的建立及其显著性

响应面试验设计及结果见表2。利用Design Expert7.1软件对表2数据进行多元回归拟合，获得的响应值抑菌圈直径(Y)对编码自变量x1、x2和x3的二次多项式回归模

对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。结果表明：模型是显著的(P＜0.0001)，失拟项不显著，回归模型的决定系数为0.9905，说明该模型能够解释99.05%的变化，仅有总变异的0.95%不能用此模型来解释，该模型拟合程度良好，试验误差小，因此，可用此模型对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的发酵条件进行分析和预测。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface tests

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis for regression equation

表4 回归方程系数显著性检验表Table 4 Significance test for regression coefficients

回归模型的显著性分析见表4。由回归方程系数显著性检验可知：模型一次项x1、x3极显著，x2不显著；二次项x12极显著，x22、x32均处于显著水平；交互项 x2x3显著，x1x2、x1x3均不显著。对回归方程进行中心标准化处理，通过回归系数绝对值大小分析各个因素的改变对该植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的影响程度。回归方程一次项的回归系数绝对值依次为x1、x3、x2，结果表明：3个因素对该菌代谢产细菌素的影响大小依次为：发酵pH值＞接种量＞发酵温度。

利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面分别见图4～6。

图4 发酵温度和pH值对植物乳杆菌KLDS1.0391所产细菌素抑菌活性影响的响应面图Fig.4 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between fermentation temperature and pH on antibacterial activity

由图4可见，两个因素的交互项不显著，由响应面可以看出，发酵温度不变，随发酵pH值的增加，抑菌圈直径先增大，当发酵pH值超过5.1后，抑菌活性呈逐渐下降的趋势。发酵温度在30～35℃，发酵pH值在4.8～5.5范围内，抑菌活性较高。乳酸菌在一定pH值条件下合成细菌素，菌体生长的最适pH值与细菌素合成的最适pH值不一定相同。Izquierdo等[10]在对屎肠球菌WHE 81产细菌素的研究中发现，菌体最适生长pH值为7.0，而细菌素生成的最适pH值为5.0。这与Nel等[11]的研究结果相符，细菌素一般在弱酸性条件下生成，发酵pH值低于菌体生长的最适pH值，细菌素产生的最适pH值具有菌株特异性。

图5 接种量和发酵pH值对植物乳杆菌KLDS1.0391所产细菌素抑菌活性影响的响应面Fig.5 Response surface and contour plot for the effect of crossinteraction between inoculation amount and pH on antibacterial activity

由图5可见，两个因素的交互项不显著，由响应面可以看出，发酵pH值不变，抑菌活性随接种量的增加而迅速增加，当接种量超过2%时，抑菌活性迅速下降。接种量在1%～2%，发酵pH值在4.7～5.5范围内，抑菌活性较高。细菌素的产量多在细菌对数生长后期达到最大值，接种量过大，缩短合成时间，产量有很大程度的下降，细菌素的活性也会降低，这可能也与细菌素吸附到产生菌菌体表面有关[12]。

图6 接种量和发酵温度对植物乳杆菌KLDS1.0391所产细菌素抑菌活性影响的响应面Fig.6 Response surface and contour plot for the effect of crossinteraction between inoculation amount and fermentation temperature on antibacterial activity

由图6可见，两个因素的交互项显著，由响应面可以看出，接种量不变，抑菌活性随发酵温度的升高而逐渐增加，当发酵温度超过35℃时，抑菌活性迅速下降。发酵温度在30～37℃，接种量在1%～2%范围内，抑菌活性较高，抑菌圈直径可达到14.95mm。菌体生长的最适温度不一定适合细菌素的生成。相关研究表明，细菌素在低于菌体最适生长温度的条件下产量较高，这与细菌素的合成机制有关，而且不同菌株产细菌素的最适发酵温度也不同[13]，扩展短杆菌ATCC9175在28℃时细菌素的产量最高，温度过高产量下降[14]，肠球菌RZSC5产细菌素的温度必须控制在35℃，温度过低或过高细菌素产量明显减少[15]。

2.3 回归模型的验证

通过上述回归模型，采用 Design-Expert 7.1软件优化发酵条件，获得植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的最适发酵条件为：发酵pH5.1、发酵温度33℃、接种量1%，在此条件下抑菌圈直径可达到15.08mm。采用上述条件进行验证实验，结果获得的抑菌圈直径为15.00mm，实验值与预测值的相对误差为0.5%，证明采用响应面法优化得到的发酵条件准确可靠，具有实用价值。未进行发酵条件优化时，细菌素的效价为420.26IU/mL，优化后细菌素的效价达到601.32 IU/mL，较优化前提高了43.08%。

3 结 论

3.1 在单因素试验的基础上，利用响应面法对植物乳杆菌KLDS1.0391代谢产细菌素的发酵条件进行了优化，建立了抑菌圈直径与发酵pH值、发酵温度、接种量3个因素的二次多项式回归模型，经验证实验证明该模型合理可靠。

3.23 个因素对该菌代谢产细菌素的影响大小依次为：发酵pH值＞接种量＞发酵温度；最优发酵条件为：pH 5.1、发酵温度33℃、接种量1%。在此条件下，发酵液的抑菌圈为15.00mm，细菌素的效价为601.32IU/mL，较优化前提高了43.08%。

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Optimization of Fermentation Conditions of Lactobacillus plantarum for Bacteriocin Production by Response Surface Methodology

CHEN Lin，MENG Xiang-chen*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The fermentation condition of Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from ,, a traditional fermented cream from Inner Mongolia in China, were optimized for bacteriocin production. Skim milk hydrolyzed by neutral protease was used as the medium; Baicillus subtilis was used as indicator bacteria and diameter of inhibition zone was used as evaluation index of antibacterial activity. Based on the single factor tests, the optimal fermentation conditions for producing antibacterial components with high yield in this strain was explored by response surface methodology with three variables of fermentation pH, fermentation temperature and inoculation amount. Results indicated that the order for affecting the yield of antibacterial components from strong to weak was fermentation pH, inoculation amount and fermentation temperature. The optimal fermentation conditions were pH 5.1, inoculation amount of 1% and fermentation temperature of 33 ℃. Under these optimal conditions, the diameter of inhibition zone reached up to 15.00 mm. The antibacterial activity was increased by 43.08% and reached up to 601.32 IU/mL. Therefore, it is feasible for the established model due to the consistent results between the prediction and experiments.

response surface；bacteriocin；Lactobacillus plantarum；Jiaoke

TQ920.6

A

1002-6630(2011)03-0176-05

2010-04-16

黑龙江省留学归国科学基金项目(LC2009C30)；国家“863”计划项目(2008AA10Z335)

陈琳(1985—)，女，硕士研究生，主要从事食品微生物研究。E-mail：chenlinlucky@163.com

*通信作者：孟祥晨(1970—)，女，教授，博士，主要从事乳品科学及食品发酵研究。E-mail：xchmeng@163.com