布氏乳杆菌对青贮发酵及其效果的研究进展

洪梅，刁其玉＊，姜成钢，闫贵龙，屠焰，张乃锋

（1.中国农业科学院饲料研究所 农业部饲料生物技术重点实验室，北京100081；2.河北北方学院，河北 张家口075000）

青贮饲料以其气味芳香、柔嫩多汁而且适口性好等特点，已经被人们接受并使用，目前，我国青贮饲料产业得到了快速发展，几乎所有的大、中、小型奶牛场所用的粗饲料都是以青贮饲料为主。青贮的原理是在厌氧条件下，通过附着于植物体的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，发酵产生有机酸（主要是乳酸），迅速降低pH值，从而杀灭或抑制各种微生物的活动，达到长期保存青绿饲料的目的［1］。随着青贮饲料产业的发展，人们基本已经能够制作优质青贮饲料，但是，饲料的腐败变质却一直是生产实践中的一个较难解决的问题。

目前很多农场的青贮饲料在饲喂前和饲喂过程中都会发生不同程度的有氧腐败。因为每次饲喂动物前取料势必会延长饲料暴露在空气中的时间；而在一些农户家中，往往是每2～3天投料1次，这样更是大大增加了青贮饲料腐败变质的几率。已经腐败变质的饲料会造成营养物质的损失，而且还会产生有毒有害物质，间接影响动物的生产性能，进而降低农民的净收入。当青贮饲料在饲喂与贮存时，一旦接触空气，条件性致病菌开始变得活跃，消耗饲料中的营养物质同时开始产热，引起青贮饲料的腐败变质。因此，在生产实践中，尽可能减少有氧变质带来的损失、提高青贮饲料的有氧稳定性、延迟二次发酵以保持青贮料的品质具有重要意义。有研究发现，有些酵母菌如假丝酵母、隐球酵母以及毕赤酵母属等，能够利用乳酸，引起饲料pH值的升高［2，3］，它们被认为是引起青贮饲料腐败变质的元凶，而霉菌、芽孢杆菌甚至乳酸菌也会在某种程度上引起饲料的腐败变质［4］。

人们尝试过很多方法，试图防止青贮饲料的腐败变质，延长饲料保存时间。例如，Kung等［5］曾使用丙酸作为添加剂以提高青贮玉米的有氧稳定性。张涛等［6］在苜蓿裹包青贮中，通过添加青贮菌剂来提高青贮产物中乙酸含量，抑制酵母菌和霉菌数量，有助于提高青贮产物的有氧稳定性。傅彤［7］使用有机酸（乙酸和丙酸）有效提高了青贮玉米的有氧稳定性。另外，山梨酸作为一种防腐剂，也能够抑制酵母菌和霉菌的生长。Wyss等［8］发现添加2g／kg山梨酸钾于黑麦草（Loliumperenne）青贮中，提高了青贮饲料的有氧稳定性。自从1996年Muck［9］首次证明，布氏乳杆菌（Lactobacillusbuchneri）可以提高青贮饲料的有氧稳定性以来，很多学者对此展开了研究。以下就布氏乳杆菌对青贮发酵、青贮质量、动物生产性能，特别是其对青贮饲料的有氧稳定性方面的影响进行详细阐述。

1 布氏乳杆菌对青贮发酵的影响

1995年以前，人们一直认为布氏乳杆菌对青贮饲料品质的作用微不足道。然而，这一看法很快被众多学者推翻，据Beck［10］报道，保存良好的青贮饲料中，植物乳杆菌和弯曲乳杆菌仅在发酵的前4d占主导地位，之后布氏乳杆菌和短乳杆菌逐渐取代它们，成为主导菌群。另外，Garzia和Giovanna［11］在23个青贮样本中分离出40株乳酸菌和球菌，其中33株属于异型发酵，而且数目最多的依次是布氏乳杆菌、短乳杆菌和植物乳杆菌。Bucher［12］发现了类似的结果，他从青贮饲料中分离出2 124株乳酸菌，其中707株是布氏乳杆菌。以上结果说明，布氏乳杆菌在饲料发酵过程中起着非常重要的作用，至少在发酵后期是主导菌群。

传统意义上的青贮接种剂，即同型发酵乳酸菌，通过增加乳酸的生成量以及乳乙酸生成比例，使青贮饲料的pH值迅速下降［13－16］。布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，它对青贮饲料发酵的影响主要是降低乳酸的含量，增加乙酸的生成量，最终使青贮饲料的pH值相对较高。Kung和Stokes［17］发现，当青贮饲料中乳乙酸的生成比例大于3时，一般是同型发酵乳酸菌占主导地位。Ward［18］也发现了同样的结果。然而，布氏乳杆菌却不符合这一标准。Kleinschmit和Kung［19］在小粒谷物青贮时，添加2种剂量的布氏乳杆菌（分别是LB1≤105cfu／g，LB2＞105cfu／g），结果表明，对照组的乳乙酸生成比例是5.3∶1.0，而LB1组显著降低到0.8∶1.0，LB2组则更低，下降到0.6∶1.0。Driehuis等［20］也有类似的研究结果，用L.buchneri40788处理饲料，结果降低了乳乙酸的生成比例，而且部分青贮饲料中乙酸含量甚至超过了乳酸含量。

1.1 布氏乳杆菌对青贮饲料有氧稳定性的影响

青贮饲料暴露于空气中会腐败变质，酵母菌被认为是引起饲料变质的元凶，它能够利用乳酸发酵，引起青贮饲料的pH值升高，从而引起条件性细菌和真菌的生长繁殖，进一步加剧饲料腐败［21］。青贮饲料在青贮窖或饲槽中保持新鲜（不变质）的能力通常用有氧稳定性表示。有氧稳定性是指青贮饲料暴露于空气中，饲料温度高于环境温度2℃所需要的时间。关于布氏乳杆菌，很多学者研究了它与各种青贮饲料有氧稳定性的关系，包括玉米（Zeamays）［22－25］、禾本科牧草［20］、苜蓿（Medicagosativa）［26］、整株小麦（Triticumaestivum）［27］、整株大麦（Hordeumvulgare）［28，29］、高水分玉米［30，31］、高粱（Sorghumvulgare）［27］和王草（Pennisetumpurpureum×P.typhoideum）［32］。这些研究结果表明，布氏乳杆菌可以明显改善青贮饲料的有氧稳定性。尽管其对有氧稳定性的提高程度不尽相同，从一天到数周不等，但所表现的积极效应是稳定的。另外，虽然有些研究结果中，布氏乳杆菌没有明显改善青贮饲料的有氧稳定性，但是当处理后的青贮饲料与其他饲料混合后，全混合日粮的有氧稳定性却显著提高［26，31］。

乙酸是很好的抗真菌物质，其含量的增加能够抑制青贮饲料中酵母的生长繁殖［33］。Kleinschmit和Kung［19］将布氏乳杆菌添加到青贮玉米和青贮小谷物中，结果发现，布氏乳杆菌处理后青贮玉米中的酵母菌数量仅为处理组的1／10，而且随着布氏乳杆菌添加剂量的增加，青贮玉米中酵母菌的数量显著降低。但是，需要注意的是，小谷物青贮未添加布氏乳杆菌组的酵母菌数量也很低，所以小谷物青贮对照组的有氧稳定性相对较高。布氏乳杆菌作为添加剂提高青贮饲料的有氧稳定性是通过抑制环境中酵母菌的生长而实现的。完全理想的情况下，青贮玉米和青贮小谷物的有氧稳定性都要高于饲料饲喂前可能暴露于空气中的时间（12～24h）。然而，自然条件下，饲喂前和饲喂过程中，空气总是能够通过各种途径渗透进青贮饲料中，如容器裂缝、每次取样时打开青贮窖、青贮料与青贮窖之间的缝隙等，因此，更应该注重有氧稳定性的相对值。

近几年有人发现，布氏乳杆菌能够产生细菌素或类细菌素，这些物质可能也有助于提高青贮饲料的有氧稳定性。细菌素是细菌在代谢过程中，通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽；这些物质可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物，如细菌素（Buchnericin，LB）只对革兰氏阳性菌有抑制作用，对革兰氏阴性菌则无抑制作用［34］。类细菌素是指不符合或不完全符合细菌素定义的蛋白类拮抗物质，它不仅能抑制革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制作用。常峰等［35］研究发现，布氏乳杆菌CF10所产类细菌素Lactobacillin FC－10在酸性条件下稳定且活性高，对革兰氏阴性菌、酵母菌和真菌有明显的抑制作用。贡汉生等［36］从乳制品中筛选得到一株产类细菌素的布氏乳杆菌KLDS1.0364，经试验发现，KLDS1.0364产生的类细菌素的作用方式是杀菌，且抑菌谱广，并可抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。迄今为止，布氏乳杆菌产生的细菌素和类细菌素都只是处于理论研究阶段，并没有真正作为添加剂使用。

布氏乳杆菌将乳酸降解成乙酸的过程中，同时伴有丙二醇的生成［37］。丙二醇的含量通常占干物质含量的2%～4%［20，38－40］，它能够通过某些有机物被转化成丙酸，但是布氏乳杆菌却没有这种功能［22］。Krooneman等［41］从青贮饲料中分离出一株乳酸菌Lactobacillusdiolivorans，含有二醇脱激酶因子，能够将丙二醇降解生成等当量的1－丙醇和丙酸，而丙酸是大家公认的抗真菌物质。然而，并不是所有的青贮饲料中都有同样的情况发生，例如，Driehuis等［20］在干物质含量为23%的青贮黑麦草中检测到了较多的1－丙醇和丙酸，但是当黑麦草干物质含量为35%时，并没有这些发酵产物的生成，相反地，却检测到大量的丙二醇。Kleinschmit和Kung［19］的研究发现，布氏乳杆菌对青贮玉米中丙酸的含量并无影响，但是却增加了青贮小谷物和青贮牧草中丙酸的含量。由此显示，不同作物将丙二醇转化成丙酸的能力不同。

1.2 布氏乳杆菌对青贮饲料中乙醇和可溶性碳水化合物含量的影响

布氏乳杆菌对不同作物青贮后乙醇含量和可溶性碳水化合物的含量也有不同的影响。如Kung等［26］的结果显示，布氏乳杆菌处理组青贮苜蓿的乙醇含量与对照组相比显著增加，Kleinschmit和Kung［19］用布氏乳杆菌处理后，青贮小谷物饲料中的乙醇含量和碳水化合物的含量都有所增加，但是青贮玉米中二者的含量变化却不显著。分析其原因，可能有二。首先，或许布氏乳杆菌能够增加青贮玉米中乙醇的生成量，但是，其增加的量远不及青贮玉米本身所含的酵母菌生成的乙醇的量，所以，结果表现为差异不显著；其次，有研究表明［37］，布氏乳杆菌在pH 3.8（约等于青贮玉米的pH值）时比pH 4.3（约等于小谷物青贮的pH值）时更容易利用碳水化合物进行异型发酵，这样必然会降低青贮小谷物中碳水化合物的含量，而增加乙醇的生成量。

2 布氏乳杆菌对干物质回收率和动物采食量的影响

目前人们已经肯定并接受了布氏乳杆菌对于青贮饲料有氧稳定性的积极作用，但是仍然有学者认为其造成了干物质的损失［42］，而且使用布氏乳杆菌后，青贮饲料中产生的高剂量乙酸会影响饲料的适口性，降低动物的采食量，进而影响动物的生产性能［43］。很多学者做了相关的研究，结果表明，用布氏乳杆菌处理过的青贮饲料饲喂奶牛［20，31］和绵羊［25］，动物的干物质采食量并没有受到影响。Kung等［26］的研究表明，布氏乳杆菌不仅没有限制动物的采食量，而且增加了产奶量。

同型发酵乳酸菌在饲料青贮过程中会造成2%～6%的干物质损失，能量损失则更少；而异型发酵过程中，因为有二氧化碳的生成，干物质损失相对较高，5%～24%不等，能量损失则通常低于2%。Weinberg等［44］测定了不同处理间（植物乳杆菌组、布氏乳杆菌组以及二者联合应用组）二氧化碳的生成量，结果显示，青贮全株小麦中，植物乳杆菌组的二氧化碳含量高于其他各组。这可能是因为植物乳杆菌组相对较多的酵母和霉菌产生二氧化碳的结果。然而，布氏乳杆菌组很好地抑制了这些有害菌的生长繁殖，所以生成的二氧化碳的总量显著少于植物乳杆菌组。Kleinschmit和Kung［19］的试验结果显示，布氏乳杆菌处理组青贮玉米的干物质损失比对照组高1.0%，而处理组青贮小谷物的干物质损失比对照组大约高1.5%。1.0%～1.5%的干物质损失与饲料腐败变质引起的损失相比是微不足道的。这些结果表明，布氏乳杆菌造成的干物质损失是可以忽略的，而且能够有效提高青贮饲料的有氧稳定性，对制作优质青贮具有重要意义［45］。

3 布氏乳杆菌使用效果分析

布氏乳杆菌对于青贮饲料的影响与青贮原料和添加剂量有很大关系。Kleinschmit和Kung［19］报道，布氏乳杆菌添加量大于105cfu／g时，接种剂对玉米青贮的效果要好于禾本科牧草和小颗粒谷物饲料；而且随着添加量的增加，3种青贮饲料的有氧稳定性都逐步提高。Ranjit和Kung［24］发现，当布氏乳杆菌的接种量为106cfu／g时，青贮饲料的有氧稳定性显著高于苯甲酸盐和丙酸添加剂的效果。然而，当接种量为105cfu／g时，其效果要低于苯甲酸盐和丙酸。另外，Kung和Ranjit［29］证明，如果添加量小于5×105cfu／g，那么布氏乳杆菌不能显著提高青贮饲料的有氧稳定性。这可能是因为，布氏乳杆菌的添加剂量不足以使其成为青贮饲料的主导菌群。

Schmidt等［46］分别用布氏乳杆菌和植物乳杆菌处理饲料，测定了发酵第240天青贮饲料中乳酸菌的数量。结果发现，乳酸菌的数量随着植物乳杆菌添加量的增加而显著增加，但是当布氏乳杆菌的接种量增加时，并没有出现相同的结果，这说明发酵第240天，布氏乳杆菌成为饲料中的主导菌群。Schmidt等［46］和Mari等［47］同样发现，布氏乳杆菌处理的青贮玉米与对照组相比，乳酸菌的数量显著增加，而且通过实时定量PCR（聚合酶链反应）方法测定可以发现处理组中布氏乳杆菌的数量显著增加。

目前，很多学者研究了布氏乳杆菌与酶联合应用效果。例如，Taylor和Kung［48］在高水分玉米青贮中同时添加布氏乳杆菌和酶，结果青贮饲料的有氧稳定性显著提高。然而，Ebling［49］的试验结果与之不一致，因为β－葡聚糖酶、α－淀粉酶、木聚糖酶和半乳甘露糖酶与布氏乳杆菌联合应用并没有提高青贮玉米的有氧稳定性。除此之外，布氏乳杆菌与同型发酵乳酸菌的联合使用也是近期研究的热点。Weinberg等［44］为检验植物乳杆菌和布氏乳杆菌对全株小麦和玉米青贮的影响，将试验分为4组，即A（对照组，不添加微生物接种剂），B（只添加植物乳杆菌组）、C（只添加布氏乳杆菌组）以及D（布氏乳杆菌和植物乳杆菌联合应用组）。青贮3个月后，D组青贮小麦的乙酸含量最高，而且没有霉菌生长；而对照组和B组的青贮饲料表层有霉菌生长。但是青贮玉米中，C组即只添加布氏乳杆菌组，饲料表层有霉菌生长，但是与对照组相比，有氧稳定性仍然较高，酵母菌数量较少，二氧化碳的生成量也相对较少。

4 布氏乳杆菌的前景展望

以前的研究中，布氏乳杆菌的计数通常采用传统的MRS（de Man，Rogosa，and Sharpe agar）培养基进行平板计数，但这种方法有很大的局限性，因为在MRS培养基上所有的乳酸菌都能够生长，所以无法准确统计布氏乳杆菌和其他乳酸菌的数量，从而给研究工作带来很多不便。近几年兴起的实时定量PCR方法能够很好的解决这一问题，Schmidt等［46］采用这种方法发现青贮过程中，布氏乳杆菌和植物乳杆菌的消长关系，并且通过对布氏乳杆菌的准确计数发现，直到青贮后期布氏乳杆菌才成为主导菌群。所以，实时定量PCR方法值得在青贮研究过程中推广并使用。

另外，随着人们对布氏乳杆菌作用的认可，越来越多的生产者开始使用这种微生物添加剂，但是其作用机理仍然不是很明确，特别是近年来发现有些布氏乳杆菌能够产生类细菌素，它们能够有效地抑制革兰氏阴性菌和真菌，但目前仅限于理论研究阶段，如果将这些类细菌素开发成添加剂直接应用在生产中，相信意义更为深远。

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