GL50分子在活化T细胞表面的表达及对细胞增殖的影响

孙中文，黄静芳，陶 鸿，易丽娴，孙 静，肖 洋

(1苏州卫生职业技术学院，江苏苏州215009;2苏州市检验医学生物技术重点实验室)

GL50分子作为B7家族的新成员，主要表达于树突状细胞(DC)、单核细胞、巨噬细胞和B细胞等抗原递呈细胞(APC)表面，参与T、B细胞的活化、分化和凋亡等［1～3］。近年研究证实，在关节炎患者的关节腔T细胞、系统性红斑狼疮患者的外周血T细胞、DC与T细胞共培养后的T细胞表面均可检测到 B7家族 B7-1的表达［4，5］。2010年3～6月，我们对GL50分子在活化T细胞表面的诱导性表达及其生物学意义进行了初步探讨，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 牛血清，RPMI1640基础培养基，健康人外周血T细胞，GL50单抗(本科室自制)，激发型CD3单抗、CD28单抗，鼠抗人 CD3单抗，Avidin-PE，Trizol，3H-TdR，淋巴细胞分离液 Ficoll;RT-PCR试剂盒，CO2培养箱，离心机，倒置显微镜及荧光显微镜，液体闪烁计数仪，流式细胞仪，RT-PCR仪;引物设计与合成由上海生工生物公司完成。

1.2 活化T细胞表面GL50分子阳性率测定 分别取不同时相(24～144 h)激发型CD3单抗联合CD28单抗活化的T细胞，用PBS洗涤2遍后分装于小试管中(5×105/管)，加入Biotin标记的GL50分子单克隆抗体各10 μl及小鼠IgG-PE 10 μl作为阴性对照，于4℃反应45min，充分洗涤后加入Avidin-PE 10 μl，于 4 ℃反应 45min，充分洗涤后采用流式细胞仪分析GL50分子阳性表达情况，同时以静止T细胞为对照。

1.3 活化T细胞表面GL50分子mRNA转录水平测定 分别取不同时相(24～144 h)激发型CD3单抗联合CD28单抗活化的T细胞，洗涤后采用Trizol一步抽提法抽提总RNA，加入随机引物和逆转录酶利用常规方法合成 cDNA。PCR反应体系为50 μl，IQ SYBR Green supermix 25 μl，上下游引物各 0.5 μl，cDNA 5 μl，PCR反应条件为94 ℃ 2min预变性，94℃ 40 s、56℃ 50 s、72℃ 1min，共40个循环。以βactin为内参照，常规PCR反应条件扩增目的DNA，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察电泳结果;以RT-PCR仪进行分析。

1.4 阻断GL50信号对T细胞增殖影响的测定鼠抗人CD3单抗包被96孔培养板，100 μl/孔，4℃过夜，吸去包被液，PBS洗涤2遍。用含15%FBS的RPMI1640培养基将活化T细胞调整为5×105/ml并随机分为A、B、C、D四组，其中A组为空白对照;其余三组分别加入终质量浓度为1 μg/ml CD3单抗、CD3单抗 +CD28单抗、CD3单抗 +CD28单抗 +GL50单抗，充分混匀后接种于96孔板(100 μl/孔)，活化24 h后分别加入终质量浓度为5 μg/ml的阻断性鼠抗人GL50单抗;3 d后加入3H-TdR(3.7×104Bq/孔)，继续培养18 h后收获细胞，液闪仪测定细胞增殖抑制率。所有实验组均设3个复孔。实验结果以测定cpm均值表示。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理。计数资料比较行χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 活化T细胞表面GL50分子阳性表达率及mRNA转录水平 ①阳性表达率:静止T细胞表面未检测到GL50分子表达;GL50分子阳性表达率在T细胞活化后24 h为17.2%、48 h为49.4%、72 h为82.5%、96 h为93.5%、120 h为95.7%、144 h为91.9%。②mRNA转录水平:T细胞活化24～144 h均有GL50分子mRNA诱导性表达上调，静止T细胞未检测到GL50分子mRNA表达。

2.2 阻断GL50分子信号后活化T细胞的增殖抑制情况 A组未出现T细胞明显增殖、B组出现T细胞轻度活化增殖、C组呈现快速增殖、D组T细胞增殖速度受到抑制，其T细胞增殖抑制率(cpm均值)分别为 217、452、37 329、22 168，D 组显著高于C组(P＜0.01)。

3 讨论

随着对共刺激分子研究的不断深入，新的B7家族成员不断被发现，这些分子主要表达于DC、单核细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细胞等抗原递呈细胞(APC)表面，参与抗原的处理和递呈。但近年实验研究证实，活化T淋巴细胞亦有部分B7家族分子表达，此使免疫应答的精确性调节变得更为复杂。本研究显示，激发型CD3单抗联合CD28单抗活化T细胞后24 h即可检测到GL50分子阳性表达，随后逐渐升高至活化120 h时达最大阳性率，并维持至活化144 h时基本不变;T细胞活化24～144 h均可检测到GL50分子mRNA表达。提示GL50分子在活化T细胞表面的表达为内源性上调所致(即均为诱导性表达)，并非来源于树突状细胞表面B7 家族分子向 T 细胞的转移［6，7］。

本研究还显示，阻断性GL50分子单抗对活化T细胞增殖具有显著抑制作用。提示GL50分子与T细胞表面的受体相互作用后可产生共刺激信号，并参与免疫应答的启动和调控。可能机制:①表达GL50分子的活化T细胞可能临时担当抗原递呈细胞的角色，和附近其他T细胞相互作用，导致后者活化、增殖、细胞因子分泌，进而形成效应性T细胞，即表达于活化T细胞表面的GL50分子在免疫应答放大效应中具有重要作用。②活化T细胞表面表达的GL50分子也可能与T细胞表面的自身受体结合，从而引起活化T细胞效应信号的自我放大。至于GL50分子在活化T细胞表面是如何参与免疫应答的精确性调节及相关调控机制，值得进一步探讨。

综上所述，GL50分子在活化T细胞表面呈诱导性表达，且可与T细胞表面自身受体结合在免疫应答放大效应中发挥重要作用。

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