细胞高密度培养技术的应用研究进展

齐士朋，徐尔尼，罗玉芬，巫小丹

(南昌大学生命科学与食品工程学院食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌，330047)

细胞高密度培养技术的应用研究进展

齐士朋，徐尔尼，罗玉芬，巫小丹

(南昌大学生命科学与食品工程学院食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌，330047)

细 胞高密度培养是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在生物反应器中高密度生长，从而获得大量的细胞及其代谢产物。该技术可以减少设备投入，缩短生产周期，降低生产成本，提高产物的比生产率，可极大地满足市场的需求。文中就国内外对该技术的应用研究及其主要的培养方式的研究状况进行了综述。

细 胞高密度培养，代谢产物，培养方式

细胞高密度培养(high cell density culture，HCDC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的目的，用于发酵生产生物制品的技术。

细胞高密度培养不仅能够提高单位体积培养液中菌体及或者是其代谢产物的浓度，强化下游分离提纯，减少废水量，而且能相应缩小生物反应器体积，缩短生产周期，减少生产

1 细胞高密度培养的应用研究

发酵是通过微生物、动物和植物细胞的培养获得所需的细胞或者是细胞的代谢产物，但是传统的细胞培养方式所得发酵液中最终的细胞浓度都不高，目前最高细胞浓度仅能达到10～20 g DCW/L，因此细胞代谢产物浓度的提高也受到了极大限制。随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标转向了以最小的代价获得最大产值和利润［1］。因此人们开始研究细胞高密度培养技术，细胞高密度培养最早应用于生产单细胞、乙醇［2］。

随着技术的发展，细胞高密度培养已经应用到很多的方面，并且取得了一定的进展。

1.1 HCDC在乳制品生产方面的研究

由于人们对乳制品的需求大量增加，促使生产商寻求乳酸菌的最佳生产方式，获得更高的生产率。

王奎明等［3］对保加利亚乳杆菌(Lac.delbrueckii subsp.bulgaricus)的高密度培养进行了初步研究，通过对合适的基础MRS培养基进行优化，确定最佳培养条件，并以流加碱中和的方法控制培养基pH，使保加利亚乳杆菌的浓度达到1.0×1012CFU/mL，比传统方式培养提高了10倍以上，实现了保加利亚乳杆菌的高密度培养。

李妍等［4］在优化增殖培养基的基础上确定 L.casei Zhang较适宜的高密度培养条件为:培养基中葡萄糖浓度为80～100 g/L，以氨水为中和剂使pH保持5.9，采用间歇通氮气的方法保持环境厌氧，在分批培养方式下，37℃保温发酵10～12 h后，L.casei Zhang细胞干重达到7 g/L，活菌数为3.5×1010CUF/mL，比优化前提高7倍以上，能够满足益生菌制品生产要求的高菌体密度。

邓鹏超等［5］针对嗜酸乳杆菌(Lac.acidophilus)所需的营养物质，采用正交分析的实验方法优化了嗜酸乳杆菌的培养基配方，另外通过全自动发酵罐培养，确定了最优的培养温度为42℃，最优的恒定培养pH为5.5，在此条件下培养9 h后添加补料，可以使菌数在15 h达到8.82×109CFU/mL，比优化前(培养16 h，获得的菌数为3.16×108CFU/mL)提高了20多倍。

1.2 HCDC在酵母工业中的研究

由于酵母已广泛地应用食品工业的发酵剂和饮料生产，实现高密度、高产率和高浓度培养是近几年酵母发酵工业的目标和方向［6］。

段学辉等［7］比较了分批培养、分批补料及连续流加培养对酒精酵母细胞生长的影响。结果分批补料流加或连续流加有利于酒精酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的快速生长和得到较高的细胞浓度，分批补料流加或连续流加培养44 h，发酵液中酒精酵母细胞浓度分别达到71.82 g DCW/L和82.01 g DCW/L，比分批培养分别提高了155.68%和191.95%。而且，酵母的有效重复利用次数达4批次。

王颖等［8］考察了培养基组成和培养条件对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵的影响。以TB培养基为初始培养基，通过正交实验设计优化培养基组成，确定了最适培养基和最佳培养条件。采用优化培养基及培养条件下进行发酵，菌液最高OD600值和细胞密度分别达14.81和2.03×108个/mL，比优化前分别提高24.2%和22.0%。

巴斯德毕赤酵母表达系统是近年发展起来的一种优秀的真核表达系统，在表达异源蛋白方面具有诸多优点。毕赤酵母发酵产物的累积不会对自身产生毒副作用，而且毕赤酵母的表达菌株很容易从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，但不影响外源基因的表达水平。这两点注定了毕赤酵母具有可用于高密度发酵的巨大潜力［9］。

余雪冰等［10］研究了毕赤酵母(Pichia pastoris)植酸酶工程菌高密度培养，对其培养条件进行了优化，获得最佳培养基:甘油4%、蛋白陈2%、酵母粉0.5%、(NH4)2SO40.8%、K2HPO40.1%、KH2PO40.6%。最适温度28℃，最适pH 6.0，最适接种量5×107个/mL。最终毕赤酵母菌体干重可达25.3 g/L，比优化前提高了5倍左右。

1.3 HCDC在工程菌方面的研究

随着生物技术在医药工业中的快速发展，越来越多的基因工程产品问世，人们在重视菌种的构建和纯化的同时，也越来越重视发酵工艺的改进。实现高密度培养是工程菌能否以尽可能低的成本实现规模生产的关键性因素之一。

陈祥仁等［13］采用新型合成培养基SIH培养重组盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)，并通过逐步提高转速和通气量，保持发酵液中溶氧量在20%以上，在7L发酵罐中重组菌AX2-pAC6-D150的最大细胞密度达到4×107个/mL以上，从而为用这一新型真核表达系统大规模生产重组异源蛋白奠定了基础。

李民等［14］研究了基因工程菌 E.coli BL21/pGEM-PEP表达重组的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(PEP)，他们选用了LB基础培养基，优化了发酵条件:转速250 r/min，培养温度为32℃，pH为7.0。利用5 L自控发酵罐经20 h培养，最终菌体密度达OD60060(相当于干菌体22.5 g/L)，PEP表达量为28%，每升发酵液中含PEP酶3.15g，最终实现了高密度培养的目的。

张雯英等［15］在小型填充床反应器中培养表达rt-PA的CHO工程细胞时，在装有5g载体的50 mL的小型填充床中培养，最高细胞数可达3.8×109个细胞，最高rt-PA浓度可达12mg/L，与小方瓶培养相比，含5g微载体填充床的小型生物反应器每天rt-PA产率与1520个25 cm2的小方瓶相当。

胡沛臻等［16］建立人黑色素瘤抗原 MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺。以摇瓶发酵结果为基础，扩大至NBS BiofloⅣ20L发酵罐发酵，利用溶氧反馈-补料分批培养技术，优化了培养条件，采用半合成培养基，诱导起始时间控制在5 h左右，IPTG诱导浓度为200 μmol/L，pH值在7.0左右，限制性流加甘油，始终保持培养液中较低的碳源浓度(5～10 g/L)。连续3批重复发酵，最终菌密度OD600均达45～50，菌体量可提高至70 g/L以上，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上。

1.4 HCDC在其他方面的研究

除了以上方面，高密度培养技术还应用到其他的方面，如保健食品螺旋藻［17］。王长海等［18］利用自制的光生物反应器对螺旋藻的生长进行了研究。结果表明:光照强度和液体循环速度对藻体细胞的生长有极显著的影响，培养温度对生长有显著的影响。通过流加NaHCO3+CO2作为碳源，在4.9 mW/cm2、0.30 m/s的液体循环速度、33℃的温度下进行培养，使藻细胞的生长速率、生物量产率和生物量产量分别达到了0.411/d、32.25 g/(m2·d)和3.93 g/L 的水平，最大生长速率达到了0.566/d。

利用高密度培养技术在环保方面的研究也是一个新的课题。耿金菊等［19］利用微生物的混合培养技术，研究了好氧条件下同时进行硝化-反硝化的生物脱氮过程，探索了实现混合脱氮微生物菌群高密度培养的条件，并使菌体表现出较高的氨氮去除能力，比常规培养提高了40.7%。

随着饲用微生物市场需求的日益扩大，将高密度培养技术应用于饲用微生物的生产，可以改进发酵工艺，提高生产率，加速饲用微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。

2 细胞高密度培养方式的研究

细胞高密度培养的方式主要有下列几种:补料分批培养、细胞循环培养、透析培养和细胞固定化包埋培养技术等。

2.1 补料分批培养

Yohsdia等人［20］首次提出了“fed-batch culture”，这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，补料分批培养的研究才开始进入理论研究阶段。补料分批培养的关键问题是最优化问题，即找出最佳的补料流加方式和最佳的培养条件，以维持发酵过程始终处于最佳状态。

潘丽军等［21］采用分批补料方式对米根霉3.819(Rhizopus oryzae 3.819)高密度培养产L-乳酸进行研究。通过葡萄糖浓度反馈流加的方式进行培养，葡萄糖初始浓度160 g/L，分批培养24 h后开始流加补料，补料液中葡萄糖与硫酸铵的质量比为20∶1。最终获得了较高的菌体密度，菌体干重达18.45 g/L;重复发酵5批次，产L-乳酸效率达2.25 g/(L·h);菌体干重和产酸效率较分批培养分别提高了92.9%和82.9%。

靳志强等［22］采用补料分批发酵和化学中和的相结合的方法，对保加利亚亚种乳杆菌S-1(Lactobacillus delbeueckii subsp.bulgaricus S-1)进行高密度培养的研究。在5L自控发酵罐中进行批次补糖实验，采用恒速流加、葡萄糖反馈流加和指数流加3种不同的补糖方式，结果证明，葡萄糖反馈流加的方式可获得较高的菌体密度，菌体干重达到3.889 g/L，较分批培养提高了43.8%。

刘馨磊等［23］在5L自动发酵罐中进行补料分批培养凝结芽孢杆菌TQ33(Bacillus coagulans TQ33)，确定了补料液中的葡萄糖与酵母膏比例，在12～26h的培养期间，将葡萄糖浓度控制在3.0～6.0 g/L的流加方式进行培养，最终菌体浓度达到4.5×109CFU/mL，芽孢浓度为1.2×109CFU/mL，分别是分批培养的5.9倍和3.8倍。

Lim等［24］在培养重组大肠杆菌(Escherichia coli)生产干扰素-a时，采用了DO-stat补料策略。分批阶段，通过调节搅拌转速和在通风口混入纯氧，维持溶氧在20%以上，补料阶段，通过调节补料维持溶氧在50%左右。最终所获得的细胞量为OD600160，最高细胞浓度提高了3倍左右。

Babu等［25］在用重组大肠杆菌TGI生产干扰素-a时，以葡萄糖作为唯一的碳源和能源，采用指数补料策略，诱导阶段的细胞量接近100 g DCW/L，最高细胞浓度提高了10倍左右。

2.2 细胞循环培养

细胞循环培养是通过沉降、离心、膜过滤等方式将细胞保留在培养罐中加以循环利用。细胞循环可以用低浓度的培养基得到高的细胞密度，可以除去抑制性代谢产物，有利于下游操作。随着膜材料技术的不断开发与完善，膜过滤得到广泛的应用。

Park等［26］采用柱形陶瓷管作为内嵌式过滤膜，连续培养啤酒酵母(Saccharomyces cerecvisiae)生产乙醇，通过周期性地去除膜表面的污垢，其过滤性能可以成功地维持2个月。所取得的生产率达13 g/(L·h)，细胞浓度达50～58 g DCW/L，分别为传统恒化培养(无膜细胞循环)的3.3倍和5倍。

Chang等［27］采用内嵌式不锈钢滤器进行连续乙醇发酵时，最大酵母细胞浓度为157 g DCW/L。

Lee等［28］采用外置式膜细胞循环反应器，对重组大肠杆菌(E.coli HB101)进行全细胞循环培养以生产青霉素酰基转移酶。通过调节葡萄糖浓度，细胞密度达到145 g DCW/L。

Kang等［29］采用内嵌陶瓷过滤系统对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiesis)进行了细胞循环培养。当补料中葡萄糖浓度为50 g/L时，获得的孢子浓度为1.6×1010CFU/mL，最大细胞量为82.2 g DCW/L，孢子含量高于95%，体积产率是分批培养的4倍。

2.3 透析培养

Osborne［30］1977年首次将透析用于乳酸杆菌(Lactobacillus)培养，获得了1×1011CFU/mL的菌体密度，相当于30～40 g DCW/L。

透析培养是通过半透膜有效的去除有害的低分子代谢产物，并向培养液提供充足的营养物质的培养方式。这种培养方式可以增加生物量的积累，降低营养物质的损失。

透析培养有下列优点:①透析培养可以增加生物量的积累，达到很高的细胞密度，约为其它发酵方法的30倍;②与微滤和超滤相比，在透析过程中透析膜不会被阻塞，并可长时间维持其渗透性能。

Markl等［31］以 Staphylococcus carnosus生产胞外脂酶，当向透析室连续不断地通入高浓度底物时，46 h内得到60 g DCW/L的细胞生物量和227 mg/L的脂酶，比传统的培养方式都有很大的提高。

Nakano等［32］在控制溶氧水平的前提下，以不同碳源透析培养大肠杆菌(E.coli)12 h，取得了极高的细胞密度。当用葡糖糖作碳源时，所得细胞量为190 g DCW/L;当用甘油作碳源时，所得细胞量为180 g DCW/L。

2.4 细胞固定化包埋培养

细胞固定化包埋培养技术是一种以应用化学或物理手段，将细胞包埋在多孔载体内部，可使细胞保持活性并可反复利用的细胞高密度培养技术。该技术大大提高了单位时间、单位容积的生产能力，使发酵产物易于与菌体分离，而且固定化细胞对杂菌的污染和代谢产物的反馈抑制作用比游离细胞具有更高的抵抗力。

Givry等［33］利用海藻酸钙固定化乳杆菌(Lactobacillus)，发酵半纤维素水解液生产乳酸，乳酸产量为62.77 g/L，而采用游离细胞发酵产量只有41.3 g/L。

贺银凤等［34］对乳酸菌(Lactobacillus bugaricus)固定化工艺参数及发酵特性进行了研究，结果表明，乳酸菌包埋法固定最佳工艺条件为:海藻酸钠的浓度为2%，菌体的稀释比例为1∶1，CaCl2溶液的浓度为1.5%，固定化温度为42℃，固定化细胞胶珠含菌量为4.59×109个/g。

齐香君等［35］研究了在柱式反应床中进行固定化乳酸菌(L.bugaricus)发酵生产乳酸，固定化细胞在柱式反应床中可以连续发酵5批次无细胞泄漏，产酸稳定，乳酸产量为69.28 g/L，未固定化细胞产酸量仅为37.6 g/L，明显提高了乳酸菌的产酸量。

柳萍等［36］利用新方法进行固定化乳酸菌发酵生产乳酸。确定固定乳酸菌的条件为海藻酸钠浓度3.0%，CaCl2浓度为5%，细胞悬浮液体积∶海藻酸钠溶液体积为1∶4。以海藻酸钙为载体包埋固定干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)发酵生产乳酸。用离子交换树脂从发酵液中分离出乳酸，分离出产物后的发酵液返回反应器循环利用。与游离细胞发酵法相比，糖转化率和乳酸生产速率分别由86.2%和0.328 g/(L·h)提高到94.7%和0.482 g/(L·h)。

3 展望

细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。

随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞(植物、动物、微生物)的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。

但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。

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Research Progress of Application in High Cell Density Culture

Qi Shi-peng，Xu Er-ni，Luo Yu-fen，Wu Xiao-dan
(State key Laboratory of Food Science and Technology，School of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

High cell density culture refers to the simulation of artificial environment of human body in bioreactor for high-density cell growth and the yield of great amount of cells and their metabolites.This technique can reduce the cost of the equipment，production，shorten the production cycle，and dramatically improve productivity to meet the market demand.This paper reviews the application research of this technique and the research condition of the key culture methods.

high cell density culture，metabolites，culture method

硕士研究生。

2010－05－31，改回日期:2010－11－16