十二指肠灌注亮氨酸对山羊胰腺外分泌功能的影响

于红霞 于志鹏 刘 凯 姚军虎 徐 明

(西北农林科技大学，杨凌 712100)

十二指肠灌注亮氨酸对山羊胰腺外分泌功能的影响

于红霞 于志鹏 刘 凯 姚军虎*徐 明*

(西北农林科技大学，杨凌 712100)

本试验旨在研究十二指肠灌注亮氨酸(leucine，Leu)对山羊胰腺外分泌及血浆指标的影响，进而为提高反刍动物小肠淀粉利用率提供理论依据。本研究采用4×4拉丁方试验设计，选用4只周岁龄关中奶山羊，手术安装十二指肠瘘管、总胆管插管，进行十二指肠Leu灌注试验(灌注水平分别为0、3、6、9 g/d)，研究Leu不同灌注水平对胰腺外分泌功能、血浆葡萄糖及胰岛素浓度的影响。结果表明:十二指肠灌注Leu，血浆中的葡萄糖和胰岛素含量、胰液分泌量、胰液总蛋白质浓度及合成速率、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的分泌均不受影响(P＞0.05)。随Leu灌注水平的提高，胰腺α－淀粉酶的分泌浓度差异不显著(P＞0.05)，而分泌速率呈先升高后降低再回升的变化规律(P＜0.05)。结果提示，Leu可不依赖于胰岛素直接长期调控山羊胰腺α－淀粉酶的分泌。

亮氨酸;奶山羊;十二指肠灌注;胰腺外分泌;胰岛素

淀粉是高生产性能反刍动物最主要的能量来源。在奶畜的泌乳初期，由于采食量下降而不能满足因泌乳水平升高而增加的能量需求，使奶畜常处于能量负平衡状态。生产中为解决这一问题，不断地增加饲粮中精饲料(主要是淀粉)的含量，使更多的淀粉到达小肠。淀粉在反刍动物小肠最终被降解为葡萄糖，其能量利用效率比在瘤胃中发酵高42%［1］，但小肠消化淀粉的能力是有限的。有研究表明，随着十二指肠淀粉灌注水平的提高，淀粉在小肠的消化量随之增加，但消化率却随之下降［2］，进入奶牛十二指肠的淀粉平均只有 67.6% 在小肠中被消化［3］。Harmon 等［4］研究指出胰腺α－淀粉酶分泌量不足是限制反刍动物小肠淀粉利用的关键因素。目前，营养物质对胰腺消化酶合成的调控机制仍不清晰，但可从转录水平和翻译水平调控蛋白质的合成，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路是翻译水平上调控蛋白质，如肌肉蛋白［5－6］、乳蛋白［7－8］和胰腺蛋白［9］合成的主要途径。单胃动物长期饲养试验表明，高蛋白质饲粮虽增强m TOR信号通路，但降低胰腺α－淀粉酶的mRNA丰度，导致胰腺α－淀粉酶的分泌量下降［10］。而对于反刍动物，增加饲粮粗蛋白质浓度，提高到达小肠的粗蛋白质含量，可增加胰腺α－淀粉酶mRNA的丰度和分泌［11］。这表明胰腺 α－淀粉酶的分泌量与其mRNA丰度呈正相关，蛋白质可影响m TOR信号通路或胰腺 α－淀粉酶mRNA丰度，调控胰腺α－淀粉酶的分泌，且其调控作用在单胃动物和反刍动物中存在差异。另有研究报道，在单胃动物长期饲养试验中，支链氨基酸抑制胰腺α－淀粉酶的分泌，尤其是亮氨酸(Leu)是最主要增强m TOR信号通路和降低胰腺α－淀粉酶mRNA丰度和分泌的饲粮因素［10，12］。而Leu对反刍动物胰腺 α －淀粉酶分泌的影响与单胃动物是否存在种间差异仍不清楚。因此，本试验旨在研究十二指肠灌注Leu对山羊胰腺外分泌(主要是α－淀粉酶)及血浆指标的影响，为提高小肠淀粉消化率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲粮

选用4只健康无病、体况相近的周岁龄关中奶山羊母羊［(30.1±1.3)kg］，试验饲粮参照NRC(1981)奶山羊饲养标准设计，由54.21%玉米青贮和45.79%精料补充料组成(干物质基础)，每天饲喂量为722 g干物质。精料补充料组成及营养水平见表1。

表1 精料补充料组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate supplement(DM basis)

1.2 试验设计与方法

本试验采用4×4拉丁方试验设计，手术安装十二指肠瘘管、总胆管插管(引流管和回流管)［14］，进行十二指肠Leu灌注试验(灌注水平分别为 0、3、6、9 g/d)，每个灌注期为 14 d，其中后4 d为样品收集期，休息期为10 d。

灌注液量为500 m L/d，灌注方法为将Leu溶解于自来水至500 m L，水浴调温至37℃，用恒流泵(BT100－12，河北保定申辰泵业有限公司)经十二指肠瘘管恒速注入，灌注过程中不断搅动，速度为0.35 m L/m in，每日连续灌注24 h。灌注期前3 d为适应期，灌注量分别为25%、50%、75%，第4天开始进行100%灌注。

1.3 饲养管理

饲养试验于西北农林科技大学生态养殖场进行，代谢笼(0.75 m ×1.50 m ×1.35 m)中单笼饲养，为保证胰酶活性，室温维持在5～10℃。试验初期称重，据体重调整采食量，试验饲粮以全混饲粮形式投喂，饲粮每日按比例配制，等分为2份，分别于08:00和18:00给饲。自由饮水。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 胰液外分泌指标

于采样期(4 d)每天连续采样6 h，采样时间分别为 09:00～14:00、15:00～20:00、21:00～02:00、03:00～08:00。每天于采样前2 h连引流袋于总胆管插管引流管，以收集胰液。采样前1 h，用50 m L无菌注射器将全部胰液经总胆管插管回流管注入体内，采样时间内每隔1 h采集胰液，记录体积，并取样10%，其余经总胆管插管回流管注入体内。每天结束将每小时样品等量混匀为1重复，－80℃保存备用。

1周内分析胰液总蛋白质含量以及α－淀粉酶、脂肪酶(试剂盒;南京建成生物工程研究所，南京)、胰蛋白酶［13］和糜蛋白酶［14］活性。其中，胰蛋白酶和糜蛋白酶需由肠激酶(100 U/L)激活后测定。

100 m L胰液中的淀粉酶在37℃与底物作用30 m in，水解10 mg淀粉为1个活性单位;1国际单位(U)的酶活性(胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶)相当于每分钟释放1μmol的产物。

1.4.2 血浆指标

采样与胰液同步，采样前安装颈静脉血插管，每隔1 h颈静脉采血5 m L，肝素抗凝(500 IU/m L)，离心(1 800 r/m in，4 ℃)25 m in，取上层血浆，抑肽素抗降解(10 000 IU/m L)，每天结束后将血浆等量混匀，－80℃保存备用。

胰岛素放射免疫试剂盒由北京北方生物技术研究所提供;血浆葡萄糖采用U－3900紫外可见分光光度计测定。

1.5 数据处理

试验数据采用SPSS 17.0统计软件的GLM模块进行方差分析，Duncan氏法多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

由表2可知，十二指肠灌注Leu，胰液分泌量、胰液总蛋白质浓度及合成速率、胰蛋白酶、脂肪酶和糜蛋白酶的分泌均不受影响(P＞0.05)。随Leu灌注水平的提高，胰液α－淀粉酶的分泌浓度差异不显著(P＞0.05)，合成速率呈先升高后降低再回升的变化规律(P＜0.05)。各处理颈静脉血浆中的葡萄糖和胰岛素含量差异不显著(P＞0.05)。

表2 十二指肠灌注Leu对山羊胰腺外分泌及血浆葡萄糖和胰岛素水平的影响Table 2 Effect of duodenal infusion of Leu on pancreatic exocrine secretion and levels of plasma insulin and glucose lovels in goats

3 讨论

十二指肠灌注Leu，各处理的胰液分泌量［(61.00 ±1.62)m L/h］及其总蛋白质浓度［(7.13±0.20)mg/m L］差异不显著。Walker等［15］及后期的几个试验显示，阉牛胰液的平均分泌速率为0.55～0.59 m L/(kg BW· h)。本试验奶山羊胰液分泌速率为2.03 m L/(kg BW·h)，高于Walker等的研究结果，这可能与单位体重奶山羊代谢率较高有关。

胰腺可分泌α－淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶，负责小肠养分的消化。反刍动物胰腺α－淀粉酶分泌不足限制了小肠淀粉的利用［4］。过瘤胃酪蛋白刺激胰腺α－淀粉酶的分泌，但不影响胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌［16］。单胃动物饲粮支链氨基酸(Leu)降低了胰腺α－淀粉酶的活性(U/mg prot)［10，12］。 本 试 验 中，十 二 指 肠 灌 注Leu，胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性、α－淀粉酶的分泌浓度(U/L和U/g prot)均不受影响，但随Leu灌注水平的升高，其胰腺α－淀粉酶的合成速率(U/h)呈先升高后降低再回升的变化规律，表明不同灌注水平Leu调控胰酶分泌的效果不同，此差异可能与其调控方式有关。

有研究报道，单胃动物长期饲养试验表明，高蛋白质饲粮可降低胰腺α－淀粉酶的mRNA丰度和分泌［10］;另有研究表明，过瘤胃灌注酪蛋白［17］或增加反刍动物饲粮粗蛋白质浓度以提高到达小肠的粗蛋白质含量［11］，可增加胰腺 α－淀粉酶mRNA丰度及其分泌量。以上研究结果表明α－淀粉酶的分泌量与其mRNA丰度呈正相关，蛋白质可在转录水平上调控胰腺α－淀粉酶的分泌，且在单胃动物和反刍动物中存在差异的主要原因可能为蛋白质对α－淀粉酶mRNA丰度的影响不同。单胃动物长期饲养试验结果表明，支链氨基酸，尤其是Leu降低胰腺α－淀粉酶mRNA丰度，抑制胰腺 α － 淀粉酶的分泌［10，12］。若假设Leu对胰腺α－淀粉酶的分泌调控亦存在种间差异，在反刍动物长期饲养试验中可能会增加胰腺α－淀粉酶mRNA丰度，刺激胰腺α－淀粉酶的分泌，与本试验Leu灌注水平在0～3或6～9 g/d范围内升高时，胰腺α－淀粉酶的合成速率线性增加的结果一致。但灌注水平为3～6 g/d时，其合成速率线性降低，原因可能与m TOR信号通路的调控有关。

m TOR信号通路主要包含上游信号通路［磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和结节性硬化复合物1/2(TSC1/2)］和下游信号通路［真核起始因子连接蛋白1(4E-BP1)和核糖体S6激酶1(S6K1)］。支链氨基酸可以通过磷酸化m TOR激活下游信号通路或直接磷酸化4E-BP1和S6K1，进一步激活mRNA翻译起始和延伸阶段［18］。同时m TOR信号通路的过度激活可以负反馈抑制上游 PI3K/AKT信号通路的激活［12］。灌注水平为3～6 g/d Leu可能负反馈抑制m TOR上游信号通路的激活，最终使胰腺α－淀粉酶分泌速率线性降低。

氨基酸(Arg、Lys、Leu)可直接刺激胰岛素的分泌;亦可通过增加葡萄糖或生长激素的分泌间接地刺激胰岛素的分泌。胰岛素可激活m TOR信号通路及其下游信号分子，调控胰腺α－淀粉酶的分泌活性;亦可影响胰腺α－淀粉酶mRNA丰度，进而影响胰腺α－淀粉酶的分泌［11］。

胰岛素在调控胰腺α－淀粉酶的分泌过程中起着重要的作用。但患有糖尿病的山羊灌注胰岛素，胰腺α－淀粉酶分泌不能恢复正常［19］，Swanson等［17］在肉牛真胃灌注试验中，发现玉米水解淀粉和酪蛋白均可增加胰岛素的分泌，但对胰腺α－淀粉酶的分泌影响却得到相反的结果。以上试验说明反刍动物对胰腺α－淀粉酶的分泌调控可能不依赖于胰岛素，支持本试验结果，通过十二指肠灌注不同水平亮氨酸，胰腺α－淀粉酶的分泌速率差异显著，但血液胰岛素和葡萄糖浓度不受其影响，因此在本试验中，胰岛素不参与Leu对胰腺α－淀粉酶的调控作用。

这与单胃动物长期饲养试验结果一致，Sans等［9］试验指出Leu可不依赖于胰岛素直接通过m TOR信号通路调控胰腺α－淀粉酶mRNA的表达。Hashimoto等［12］试验指出小鼠采食高支链氨基酸(Leu)饲粮7 d，胰腺α－淀粉酶分泌降低，但血液胰岛素含量不变。同时本课题组短期十二指肠Leu灌注试验(数据未公布)也发现Leu可短期刺激胰岛素的分泌。短期和长期饲养试验结果不一致，原因可能为在长期灌注试验中，动物产生适应性调节，使血液葡萄糖和胰岛素水平处于稳态。

4 结论

Leu可不依赖于胰岛素直接长期调控山羊胰腺α－淀粉酶分泌。

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*Corresponding author，YAO Junhu，professor，E-mail:yaojunhu2004@sohu.com;XU Ming，lecturer，E-mail:xum ing16899@sina.com

(编辑 赵天章)

Infusion of Leucine into Duodenum A ffects Pancreatic Exocrine Secretion of Goats

YU Hongxia YU Zhipeng LIU Kai YAO Junhu*XU Ming*
(College of Animal Science＆Technology，Northwest A＆F University，Yangling712100，China)

The experiment was conducted to investigate the effect of duodenal infusion of leucine(Leu)on pancreatic exocrine secretion and plasma indices in goats.Four one-year-old goats ［(30.1 ±1.3)kg］fitted with duodenal fistulas and common bile duct cannulaswere used in a 4×4 Latin square design.Each goat

four treatments:infusion of 0，3，6 and 9 g/d Leu into duodenum，respectively.The results showed that duodenal infusion of Leu didn’t affect concentrations of glucose and insulin in plasma，total pancreatic juice secretion，total protein concentration and production rate in pancreatic juice，and activities of trypsin，chymotrypsin，lipase and pancreaticα-amylase(P＞0.05).However，the secretion rate of pancreatic α-amylase was increased when the infusion level of Leu was 3 or 9 g/d(P＜0.05).The results indicate that Leu can directly long-term regulate the secretion of pancreatic α-amylase independent of insulin in goats.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1513-1518］

leucine;goat;duodenal infusion;pancreatic exocrine;insulin

S826

A

1006-267X(2011)09-1513-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.009

2011－04－11

国家自然科学基金(31001021);科技部国际科技合作与交流专项(2010DFB34230);陕西省‘13115’科技创新工程工程技术研究中心(2010ZDGC-02)、重大科技专项(2009ZDKG-18);陕西省农业攻关项目(2009K01-02)。

于红霞(1986—)，女，山东泰安人，硕士研究生，从事动物营养与饲料科学研究。E-mail:yuhongxia.cool@163.com

*通讯作者:姚军虎，教授，博士生导师，E-mail:yaojunhu2004@sohu.com;徐 明，讲师，E-mail:xum ing16899@sina.com