尿素免疫脂质体的制备及理化性质研究*

陕西省人民医院普外科(西安 710068) 段降龙 龙延滨 李国威

医用尿素(Medical urea)是非手术治疗血管瘤的常用药物之一,尿素可使血管瘤血管内皮细胞发生皱缩、变性、坏死,进而纤维化,从而达到治疗血管瘤的目的[1]。但是临床应用过程中发现尿素治疗血管瘤周期长,合并多种并发症。为了克服这些缺点,我们研究以血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的单克隆抗体作为偶联抗体制备尿素免疫脂质体,并对其理化特性进行初步研究。

材料和方法

1 主要试剂和仪器 医用尿素(西安交通大学医学院第二附属医院),胆固醇(上海生化试剂公司),注射用大豆磷脂(上海太伟药业有限公司),Anti-human VEGF R2单克隆抗体(美国 R&D Systems公司),Coomassie蛋白质定量试剂盒(Bio-Rad公司 )。85p-72型低温超速离心机(日本 HIT ACHI公司),BP-190S电子天平(德国赛多利司公司),RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),UV-265紫光分光光度计(日本岛津公司),KQ-250超声波发生器(江苏昆山淀山湖检测仪器厂),TEM-2000EX型透射电子显微镜(日本电子公司)。

2 方 法 ①制备尿素脂质体:采用逆相蒸发法制备脂质体。经过大量预实验和单因素考察,确定乙醚的用量,药物浓度,磷脂和胆固醇的用量及超声时间等,优选出制备工艺条件。将大豆磷脂、胆固醇按重量比 4∶ 1的比例混合,溶入 5ml乙醚中,加入尿素 2.4g和蒸馏水 5ml,在超声波发生器上进行 10min超声,直至形成稳定的 W/O型乳剂。在 25℃条件下旋转蒸发仪减压蒸发,除去乙醚。达到胶态后,滴加蒸馏水 5ml水化。依次过 0.8 μ m,0.45 μ m的微孔滤膜。最后在减压下继续蒸发,制得尿素脂质体,即浓度为 24%的尿素脂质体 10ml。②制备尿素免疫脂质体:取 24%的尿素脂质体溶液 1.0ml,加入 25%的戊二醛 25 μ l,于20℃放置 10min,过量戊二醛通过生理盐水透析除去,透析时间 2h。中间换 1次液,加入 0.5mg VEGFR2(flk-1/KDR)单克隆抗体,4℃过夜,即制得 24%的尿素免疫脂质体。经 60Co灭菌后 4℃贮存。③尿素免疫脂质体形态学特征观察:取尿素免疫脂质体原液、稀释10倍液、稀释 100倍液各 1滴,分别滴于 Formwan膜铜网上,2%磷钨酸负染,静置放干燥。透射电镜观察尿素免疫脂质体的形态特征。④包封率的测定:取尿素脂质体 0.5ml,将其加至 Sephadex-50柱顶端,然后自顶端滴入去离子水,分别收集滴出液至试管中,每支试管收集 3ml滴出液。滴出液流速为 1ml/min,室温下层析。5ml比色管中分别依次加入试管滴出液,PDAB显色剂,放置 10min后在分光度计上,于 440nm处测定吸光度值,以不含尿素脂质体的试剂溶液作参比。⑤偶联率的测定:通过密度梯度离心法将免疫脂质体分离,分别测定分离液中脂质体和蛋白含量。同时含有脂质体和蛋白的分离液中蛋白含量即为偶联上的VEGFR2单克隆抗体量。

结 果

1 尿素免疫脂质体形态学特征 尿素免疫脂质体肉眼观为乳白色混悬液,放置不易产生沉淀,储存 6个月剂型外观无明显变化。透射电镜观察尿素免疫脂质体稀释 10倍液较原液易观察,可见散在分布的尿素免疫脂质体(图 1),分布均匀,但有大量的尿素免疫脂质体重叠,难以观察。尿素免疫脂质体稀释 100倍液在透射电镜下可见到典型的尿素免疫脂质体形态(图2)。尿素免疫脂质体多为大单层脂质体,呈球形或近球形,直经约 150～200nm,可见到“类核仁”结构,尿素免疫脂质体形成的包膜结构和脂质双分子膜规整。

图1 尿素免疫脂质体镜下形态(透射电镜,×25000)

图2 尿素免疫脂质体镜下形态(透射电镜,×40000)

2 脂质体包封率测定结果 依据葡聚糖凝胶柱工作原理及各试管尿素含量测定结果,绘制尿素脂质体洗脱曲线(图 3)。从洗脱曲线可以看出尿素含量呈双峰曲线,第一个峰曲线为脂质体包封尿素的含量,约为 410 μ g,第二个峰曲线为脂质体未包封的游离尿素含量 ,约为 344 μ g,总尿素含量为 754 μ g,尿素柱回收率达 97.73～ 96.79%。按照中国药典 2000年版的脂质体包封率计算公式计算尿素脂质体包封率,即包封率=(W总-W游)/W总×100%,W总为总药物量,W游为未包入脂质体的游离药物量。尿素脂质体包封率=脂质体包封尿素含量 /总尿素含量×100%=410/754× 100%=54.4%。

图3 尿素脂质体洗脱曲线

3 脂质体偶联率测定结果 由各层提取液蛋白含量测定值得出偶联上的 VEGFR2单克隆抗体量约为 184.2 μ g/ml。 依据偶联率计算公式(偶联率=偶联上的蛋白质量 /起始蛋白质量×100%)计算出尿素免疫脂质体偶联率约为 36.84%。

讨 论

尿素亦称羰基二氨,分子量为 60.60。结晶的尿素呈粉状雪白色固体,可溶于蒸馏水、生理盐水及 0.25～2%的普鲁卡因溶液中,水溶液呈中性(pH7.2～ 7.3)。临床应用显示尿素治疗血管瘤疗效肯定。但是由于尿素治疗血管瘤缺乏靶向治疗作用,尿素注入血管瘤体后,在血流的作用下,逐渐分散,难于在瘤体内形成高浓度聚集,往往需多次注射治疗,使治疗周期延长,增加患儿痛苦;并且由于尿素浓度过高,单位时间内用药量过大,尿素局部注射可引起皮肤组织坏死,局部溃破,感染等并发症;同时亦可造成邻近正常组织器官的血运障碍,引起发育畸形。为了减少尿素治疗血管瘤的并发症,缩短治疗周期,我们研究用脂质体包裹尿素,以保护尿素,延缓其生物降解,尿素从脂质体中缓慢释放,药效持续时间长;同时通过细胞内吞和融合作用,脂质体直接将尿素送入细胞内,避免使用高浓度游离尿素,减少尿素用量,降低尿素治疗血管瘤后并发症的发生。脂质体是由双分子层组成,内部为水相的囊泡结构,结构类似生物膜。脂质体作为药物载体是当前极受重视也是最有前途的药物靶向系统[2]。脂质体本身无特异靶向性,可在偶联剂的作用下,将特异性抗体或受体连接到脂质体表面,得到专一性作用于靶细胞的免疫脂质体,从而大大提高了药物的作用。

VEGFR2是一个非常重要的血管生成调节物,为跨膜受体,其与血管瘤的发生和发展有非常密切的关系[3];本研究将 V EGFR2的单克隆抗体作为尿素免疫脂质体的偶联抗体,采用交联法中戊二醛法,即用戊二醛作为偶联剂,使其两端的醛基分别与磷脂的-NH2和抗体的-NH2缩合,从而将己制备好的尿素脂质体与VEGFR2的单抗隆抗体偶联,制得尿素免疫脂质体。包封率是指包封在脂质体内的药物量占加入药物的百分比,是评价脂质体质量好坏的重要指标[4]。本研究采用葡聚糖凝胶柱层析法分离尿素脂质体和游离尿素。将测得的总尿素含量和游离尿素含量代入包封率计算公式,得到脂质体包封率约为 54.4%。影响脂质体包封率的因素很多,如药物-类脂比,药物的性质以及制备方法等[5]。在其它条件相同情况下,脂质体中药物的包封率最主要的由药物本身性质所决定的。一般情况下,脂溶性药物比水溶性药物更易于包封,分子量大药物可以获得较高的包封率。本研究中,脂质体包裹的药物-医用尿素 ,为水溶性药物,呈中性,分子量较小,约60.60,故与脂溶性药物相比,脂质体包封率偏低。当处方组成相同,使用不同的制备方法,可以得到不同结构的脂质体,逆相蒸发法、熔融法得到的脂质体包封率较高,有文献报道脂质体包裹水溶性药物的包封率多小于 45%[6]。本研究采用逆相蒸发法制备脂质体,制得的脂质体为大单室脂质体,故脂质体的包封率较其他文献高,粒径适宜,结果满意。类脂的组成也是影响包封率的主要原因之一,对于水溶性药物来讲,适当提高磷脂-胆固醇中胆固醇的量,可以增加脂质体中水相的体积,从而提高药物的包封率[7]。本研究发现,当磷脂和胆固醇的重量比例为 4∶1时,尿素脂质体包封率最高。

药物-类脂的比例亦影响脂质体的包封率。一般提高类脂的比例可以提高包封率,因为类脂成分的增加有助于形成更多的脂质囊泡,以提供更多的包裹空间,有利于药物与脂质的相互作用[8]。本研究发现药脂之比为 1∶60时,尿素脂质体的包封率较高。油水比亦影响尿素脂质体的包封率。油水比小时,不能很好地形成稳定的油包水型乳液,油水比过高,则脂质体中包入的水溶性药物绝对量太少[9]。本研究发现尿素脂质体的油水比为 5∶1时,包封率较高。

水相介质的不同对包封率也有较大影响。有研究者报道[10]以蒸馏水、0.9%氯化钠和 5%甘露醇溶液为水相制得的阿昔洛韦脂质体,包封率分别为 65%、46%和 55%,提示蒸馏水作为水相介质包封率较高。本研究发现 10ml的蒸馏水已能提供足够的水相空间容纳加入的注射用尿素,如果再增加水的量反而易造成药物的渗漏,使包封率下降。

偶联率是反映免疫脂质体质量好坏的重要指标。影响偶联率的因素很多,包括偶联方法、偶联抗体的类型,脂质体制备方法等。有研究者报道[11]随着抗体质量浓度的增加,抗体交联脂质体的蛋白质量先增加后降低,提示抗体质量浓度具有饱和性;应用交联法制备免疫脂质体的关键是控制偶联剂的浓度、磷脂比例和偶联时间。本研究检测尿素免疫脂质体的偶联率为36.84%。若能对抗体进行预处理,筛选反应条件,设置最佳反应温度和时间,抗体和脂质体最佳配比,尿素免疫脂质体的偶联率可望进一步提高。

[1] 李恭才,顾建章.小儿血管瘤[M].西安:陕西科学技术出版社,1991:49.

[2] Sharma G,Anabousi S,Ehrhardt C,et al.Liposomes as targeted drug delivery systems in the treatment of breast cancer[J].J Drug Target,2006,14(5):301.

[3] WalterJW,North PE,Waner M,et al.Somatic mutation of vascular endothelial growth factor receptors in juvenile hemangioma[J].Genes Chromosomes Cancer,2002,33(3):295.

[4] Stuart DD,Semple SC,Allen TM.High efficiency entrapment of antisense oligonucleotides in liposomes[J].Methods Enzymol,2004,387:171.

[5] 郭海燕,莫慧林.脂质体物理稳定性和包封率的影响因素[J].中国新药杂志,2004,13(6):448.

[6] Law SL,Huang HY.Properties of acyclovir-containing liposomes for potential ocular delivery[J].Int J Pharm,1998,161(2):253.

[7] Were LM,Bruce BD,Davidson PM,et al.Size,stability, and entrapmentefficiency ofphospholipid nanocapsules containing polypeptide antimicrobials[J].J Agric Food Chem,2003,51(27):8073.

[8] 于波涛,张志荣,刘文胜.提高脂质体包封率的方法及研究进展 [J].中国医药工业杂志,2002,33(11):564.

[9] Frkanec R,Travas D,Krstanovic M,et al.Entrapment of peptidoglycans and adamantyltripeptides into liposomes:an HPLC assay fordetermination ofencapsulation efficiency[J].J Liposome Res,2003,13(3-4):279.

[10] Wu J,Zhu J.Preparation of acyclovir liposome and study on its stabibity[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2003,38(7):552.

[11] 林俏慧,缪 珑,活 力.抗体交联脂质体的制备 [J].华南理工大学学报,2003,31(9):76.