Myostatin重组蛋白疫苗对小鼠骨骼肌质量和力量的影响

唐量 张万金 王园丽 张英起

1 陕西师范大学体育学院运动分子生物学实验室（西安 710062） 2 第四军医大学生物技术中心

运动和药物治疗多年来一直是临床预防和治疗肌萎缩的重要方法。除研究不同运动如耐力训练、抗阻力训练或被动运动训练等治疗肌肉萎缩的方法及机制外，寻找新的药物靶分子也十分必要。最近的实验证明，肌肉萎缩与Myostatin异常表达升高密切相关。Lalani等［1］对雄性成年大鼠进行17d模拟失重后证实，股二头肌、股四头肌、腓肠肌Myostatin mRNA和蛋白水平显著高于对照组。Michelle等［2］对Wistar大鼠进行10d后肢悬吊，发现Myostatin mRNA升高110%，蛋白水平上升37%。人体实验证明，成年男性卧床25d，伴随着瘦体重、肌肉量下降，血液Myostatin浓度高于基础值12%［3］。以上研究说明模拟失重、后肢悬吊或卧床等诱发的废用性肌肉萎缩可引起肌肉组织Myostatin表达异常升高，但针对Myostatin靶分子治疗废用性肌肉萎缩方面的研究报道仍少见。

Myostatin是骨骼肌生长发育的主要负调控因子，属于TGF-β超家族新成员，因其基因敲除后出现“双肌”症状［4］而倍受关注。目前众多研究报道了抗阻力运动［5，6］和游泳训练［7］等对Myostatin基因和蛋白表达的影响，证明抗阻力训练和耐力训练使肌肉肥大与Myostatin关系密切。本课题组近年来报道了Myostatin对骨骼肌生长发育调控的研究进展［8］和Myostatin基因多态性在杰出运动员选材中的应用展望［9］，但有关蛋白水平上Myostatin活性抑制对骨骼肌质量和力量影响的报道还少见。要准确了解运动或Myostatin抑制剂干预Myostatin活性在肌肉形成中的作用机制，蛋白水平上的研究尤为重要。我们前期已利用基因工程技术构建、表达和纯化了高纯度、无活性的Myostatin重组蛋白［10］，本实验以Myostatin重组蛋白作为疫苗免疫小鼠，观测小鼠体重、肌细胞形态、骨骼肌质量和力量等指标的变化，探讨Myostatin蛋白疫苗调控骨骼肌质量和力量的效果及分子机制。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

实验动物为雄性BALB/c小鼠，体重12～14g，共20只，购自第四军医大学实验动物中心。20只小鼠分成正常对照组和His-Ms免疫组2组，每组10只。小鼠饲养环境保持高度清洁，自然光照，自由饮水和进食，动物室温23～28℃，相对湿度50%～65%。适应性喂养1周后His-Ms组小鼠进行免疫实验。

1.2 免疫方案和体重

免疫蛋白His-Ms为基因工程技术构建、表达和纯化的高纯度、无活性的Myostatin重组蛋白［10］。His-Ms 组小鼠按100 μg/只剂量进行腹腔注射，每两周免疫1次，共免疫4次［11］。正常对照组动物在实验组进行免疫时腹腔注射相等体积的生理盐水。实验期间，每周一、四早上10:00称体重，取两次称重的平均值为每周体重。

1.3 取材

实验共进行62 d，最后一次免疫20 d后对照组和His-Ms组小鼠同时取材，眼眶采集血样，然后迅速取出腹腔内的游离脂肪组织称重，再分离股四头肌、腓肠肌和胸大肌，剥离附着在肌肉组织的包膜等非肌纤维组织，称重并记录。

1.4 骨骼肌形态分析

分离肌肉组织，在4℃固定液（10%中性福尔马林，50 mmol/L PBS，pH7.2）中固定24 h，后在肌中间最隆起部位切片，置于4℃溶液（5%蔗糖，50 mmol/L PBS，pH7.2）中过夜，预冷的50%丙酮脱水，纯丙酮脱水2次，二甲苯透明，浸蜡，石蜡（54℃～56℃）包埋，切片，HE（hematoxylin and eosin）染色，生物显微镜（Olympus IX70， 日本Olympus公司）观察。为分析小鼠肌肉组织重量增加与肌细胞肥大（hypertrophy）或肌细胞增生（hyperplasia）之间的关联，实验利用Scion Image4.02软 件（http：//www.scioncorp.com）， 从对每组随意选6只小鼠共1000个股四头肌细胞的横断面积和每束肌纤维的平均细胞数，按Lee等［12］报道的方法进行统计分析。

1.5 血清常规指标测定

采用全自动生化分析仪（日本日立公司）检测血清胆固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、尿素氮（BUN）、血糖（GLU）、肌酸激酶（CK）等血液指标。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.6 抓力测试

小鼠处死前1d对其前肢抓力进行测试。参考并改进Peled-Kamar等［13］报道的前肢抓力测试方法，在离地高80 cm处绑紧一根直径2 mm的绳子，让小鼠前肢握住绳子，并固定尾部，记录小鼠掉落前持续握住绳子的时间，即完成一次抓力测试。重复3次取平均值。抓力测试重复间隔时间尽可能一致。

1.7 细胞ELISA测定小鼠蛋白疫苗血清抗体滴度

利用PVAC-Ms转染并鉴定可表达Myostatin蛋白的CHO细胞［14］，转染36h后，吸去培养液，37℃干燥后用0.025%戊二醛（PBS配制，pH7.4）室温固定20 min，PBS洗孔3遍。每孔加入200 µl含3% H2O2PBS，室温反应20 min，PBS洗孔3遍。在细胞包被孔中分别加入两组各6只小鼠不同稀释度的待测血清，每孔200 µl，设复孔，阴性对照，37℃温箱反应l h，用洗液洗3遍。加入1:10000生物素化的羊抗小鼠IgG抗体，每孔200 µl，37℃反应l h，洗孔3遍，甩干。加入1:200亲和素化辣根过氧化物酶，每孔200 µl，37℃反应30 min，洗孔3遍。加OPD-H2O2底物200 µl，37℃避光反应，加2M H2SO4终止反应。酶标仪（美国Bio-Rad公司）测各孔OD450nm值。

1.8 统计学分析

用Excel 2000对所测数据进行统计处理，实验结果以均数±标准差（）表示，进行两组间非成对均值t检验，P < 0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 小鼠体重变化和组织重量比较

由图1可见，第6周开始至实验结束，His-Ms组免疫小鼠体重增加幅度略大于正常对照组。表1显示， His-Ms组小鼠最后一周体重与正常对照组比较平均增加3.6%，但无统计学意义。与正常对照组比较，His-Ms组小鼠股四头肌和胸大肌重量显著增加，腓肠肌重量虽增加但无显著性差异；腹腔脂肪垫重量无显著性变化。

表1 两组小鼠体重、肌肉和腹腔脂肪垫重量比较

2.2 小鼠骨骼肌细胞显微结构

股四头肌组织化学染色光镜观察结果显示，对照组和His-Ms组小鼠肌细胞形态均正常，细胞结构完整（图2A）。与对照组比较，His-Ms组小鼠股四头肌横断面积增加了5.6%，有统计学意义（图2B），而股四头肌每束肌纤维平均细胞数目两组之间无明显差别（图2C）。

2.3 小鼠血清指标

表2显示，各血清指标两组之间无显著差别。

2.4 小鼠前肢抓力测试

正常对照组前肢抓力测试时间为33.5±2.7 s，His-Ms组为46.5±7.0 s，与正常对照组比较增加了26.6%，差异显著（P<0.05）。

2.5 小鼠血清平均抗体滴度

表2 两组小鼠血清指标的变化

图3显示，在血清稀释2×102倍时，对照组OD450nm值为0.363，His-Ms组 OD450nm值为 0.794，His-Ms组与对照组OD450nm比值大于2.1，由此判断血清抗体为阳性；而在血清稀释2×103和2×104倍时，His-Ms组与对照组的OD450nm比值小于2.1，判断血清抗体为阴性，表明His-Ms蛋白免疫小鼠后抗体效价达到2×102。

3 讨论

本实验结果显示，针对Myostatin的免疫蛋白诱导的特异性抗体平均滴度在2×102以上，并对免疫小鼠体重、肌肉质量和抓力均产生影响。与正常对照组比较，免疫小鼠体重平均增加了3.6%，股四头肌、腓肠肌和胸大肌重量分别增加了11.2%、3.2%和15.8%，前肢抓力平均增加了26.6%，而小鼠腹腔游离脂肪组织和血清CHO、TG各组之间无明显差别，推测免疫小鼠体重增加可能与肌肉重量增加有关，与脂肪堆积无明显关联。本实验中，与正常对照组比较，His-Ms组免疫小鼠股四头肌横断面积增加了5.6%，而股四头肌每束肌纤维平均细胞数目两组之间无明显差别，初步表明免疫小鼠骨骼肌质量增加可能与骨骼肌肥大有关，而与肌细胞增生无明显关联。Whittemore等［15］研究证明，成年小鼠注射抗Myostatin抗体后，肌肉质量和抓力显著增加，与本实验结果基本一致。但Myostatin重组蛋白疫苗克服了抗体类药物价格昂贵、用药量大、长期反复、易引起超敏反应等缺点，是抑制体内Myostatin活性的一种新途径，易于在肌肉萎缩的临床治疗中应用。我们前期有关 Myostatin自体疫苗的制备及临床前基础研究成果已获发明专利授权（No. 200610104728.4）。

本实验中，无活性Myostatin免疫蛋白使小鼠骨骼肌质量和力量增加可能与免疫诱导的抗体和 Myostatin特异性结合进而抑制其活性有关。Myostatin成熟肽包含9个保守的半胱氨酸残基，在血液中通过二硫键连接形成二聚体，活化的Myostatin以二聚体形式与受体结合发挥该蛋白的生物学功能［16］。目前证实能与Myostatin成熟肽结合并抑制其活性的分子有其前肽、Follistatin、Follistatin-related gene（FLRG）及其受体Act RIIB拮抗剂等，肌肉表型与Myostatin基因敲除动物的类似［9，17］。实验诱导的特异性抗体与 Myostatin 二聚体结合，可竞争性抑制该分子与受体的结合而封闭其作用，相关的理论推测需要下一步竞争性抑制实验来证实。

运动使骨骼肌负调控因子Myostatin基因表达趋于下调，同时促进骨骼肌正调控因子IGF-I表达趋于上调［18，19］，但也有不一致的报道［3］。Zdanowicz等［20］利用IGF-I治疗后肢悬吊10d的废用性肌萎缩大鼠模型后发现，大鼠体质量和肌质量显著恢复，对治疗废用性肌肉萎缩有效。而有关Myostatin在治疗废用性肌肉萎缩方面的研究仍少见，本实验结果为Myostatin靶分子应用于废用性等肌肉萎缩的治疗提供了实验参考，并为航空航天医学中研究失重性肌肉萎缩的难题提供了新思路。

4 总结

利用基因工程技术构建、表达和纯化的无活性His-Ms蛋白免疫小鼠后，可诱导其产生特异性抗体，使免疫小鼠瘦体重、骨骼肌质量及抓力均有不同程度增加，表明Myostatin重组蛋白疫苗His-Ms是抑制体内Myostatin活性的一种新途径，对动物骨骼肌质量和力量增加有一定促进作用。

［1］Lalani R，Bhasin S，Byhower F，et al. Myostatin and insulin-like growth factor-1 and -2 expression in the muscle of rats exposed to the microgravity environment of the neurolab space shuttle flight. J Endocrinol，2000，167（3）：417-428.

［2］Michelle W，Baiyuan C，James GT. Modulation of myostatin expression during modified muscle use. FASEB J，2000，14（1）：103-110.

［3］Zachwieja JJ，Smith SR，Sinha-Hikim I，et al. Plasma myostatin -immunoreactive protein is increased after prolonged bed rest with low-dose T3 administration. J Gravit Physiol，1999，6（2）：11-15.

［4］McPherron AC，Lawler AM，Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member. Nature，1997，387（6628）：83-90.

［5］Stephen MR，Gregory FM，Robert EF，et al. Myostatin gene expression is reduced in human with heavyresistance strength training; a brief communention. Exp Biol Med，2003，228（6）：706-709.

［6］Hulmi JJ，Ahtiainen JP，Kaasalainen T，et al. Postexercise myostatin and activin IIb mRNA levels：effects of strength training. Med Sci Sports Exerc，2007，39（2）：289-297.

［7］Matsakas A，Bozzo C，Cacciani N，et al. Effect of swimming on myostatin expression in white and red gastrocnemius muscle and in cardiac muscle of rats. Exp Physiol，2006，91（6）：983-994.

［8］唐量，刘军. Myostatin对骨骼肌生长发育调控的研究进展. 西安体育学院学报，2008，25（4）：77-81.

［9］胡柏平，唐量，张英起. Myostatin 基因多态性在杰出运动员选材中的应用展望. 体育科学，2009，29（2）：71-75.

［10］唐量，王园丽，张万金，等. Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定. 陕西师范大学学报（自然科学版），2010，38（6）：77-81.

［11］E.哈洛，D.莱恩著；沈关心，龚非力译. 抗体技术实验指南. 北京：科学出版社，2002.18-25.

［12］Lee SJ，McPherron AC. Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（16）：9306-9311.

［13］Peled-Kamar M，Lotem J，Wirguin I，et al. Oxidative stress mediates impairment of muscle function in transgenic mice with elevated level of wild-type Cu/Zn superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（8）：3883-3887.

［14］唐量，胡柏平，熊正英，等. Myostatin 基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达. 体育科学，2008，28（12）：45-49.

［15］Whittemore LA，Song K，Li X，et al. Inbibition of myostatin in adult mice increnses skeletal muscle mass and strength. Biochem Biophys Res Commun，2003，300（4）：965-971.

［16］Langley B，Thomas M，Bishop A，et al. Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J Biol Chem，2002，277（51）：49831-49840.

［17］Yang J，Ratovitski T，Brady JP，et al. Expression of Myostatin pro-domain results in muscular transgenic mice. Mol Reprod Dev，2001，60（3）：351-361.

［18］Bamman MM，Shipp JR，Jiang J，et al. Mechanical load increases muscle IGF-I and androgen receptor mRNA concentrations in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab，2001，280（3）：E383-E390.

［19］Singh MA，Ding W，Manfredi TJ，et al. Insulin-like growth factor I in skeletal muscle after weight-lifting exercise in frail elders. Am J Physiol，1999，277（1 Pt 1）：E135-E143.

［20］Zdanowicz MM，Teichberg S. Effects of insulin-like growth factor-1/binding protein-3 complex on muscle atrophy in rats. Exp Biol Med（Maywood），2003，228（8）：891-897.