香菇多糖对免疫抑制小鼠肠道派氏结T细胞的影响

江益平，马方励，周 联，王 青，董 燕

(1.广州中医药大学临床药理研究所免疫研究室;2.无限极(中国)有限公司，广州广东 510405)

早在1968年，日本科学家就利用热水浸提法从香菇子实体中提取、分离、纯化出6种胞外多糖，lentinan、LC-11、LC-12、LC-13、EC-11 和 EC-14，同时他们发现这6种多糖中lentinan和LC-11具有抗肿瘤的生物学活性［1］。经过对香菇多糖的构效关系的研究，人们发现具备β-(1→3)连接的葡聚糖主链同时连接β-(1→6)侧链的香菇多糖均会表现明显的生物学活性，且分子量越大，生物学活性越显著［2］。香菇多糖的抗肿瘤活性被认为与其活化T细胞，促进白细胞介素产生，增强巨噬细胞吞噬功能等免疫调节作用密切相关，临床也已经将其作为肿瘤治疗的辅助药物［3-4］。但是，有关香菇多糖对肠道黏膜免疫系统的免疫调节作用至今少见报道。本实验首先从体重增长趋势、胸腺指数、脾淋巴细胞增殖能力和DTH反应能力方面确定香菇多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠的系统免疫功能的影响。同时，在DTH模型基础上，通过免疫抑制小鼠小肠派氏结数目以及派氏结中T淋巴细胞比例和活化情况观察香菇多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠肠道派氏结T淋巴细胞的影响，以确定香菇多糖对肠道黏膜免疫系统的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1动物和药物NIH小鼠，♂，6～8周龄，体质量18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(粤)2006-0015。香菇多糖喷干粉由无限极(中国)有限公司提供，依照文献描述的硫酸-苯酚法结合3，5-二硝基水杨酸比色定糖法检测多糖的含量为 0.52［5］;环磷酰胺(Cyclophosp homide，CY)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号H32020875。

1.2试剂、耗材和仪器2，4-二硝基氟苯(DNFB)为日本东京化成工业株式会社产品;RPMI 1640培养基，为Gibco产品;胎牛血清(FBS)，为PAA产品;美洲商陆(PMW)、刀豆蛋白 A(ConA)和MTT为Sigma产品;APC-anti-mouseCD3，PE-anti-mouse CD69，FITC-anti-mouse CD4，PE-anti-mouse CD8 为eBioscience产品。96孔平底培养板，美国Corning公司产品;其它试剂均为进口分析纯或国产分析纯试剂。多功能酶标仪，瑞士TECAN公司;电子分析天平，德国Sartorius产品，d=0.1 mg;流式细胞仪，美国BD公司;台式冷冻高速离心机，美国Beckman产品。

1.3统计学处理实验数据以±s表示，采用SPSS11.5统计学软件进行数据处理，统计方法应用单因素方差分析。

1.4方法

1.4.1LNT对肠道黏膜免疫系统的影响

1.4.1.1动物分组、给药和DTH模型建立 28只NIH小鼠按体重随机分成4组，正常组、模型组、香菇多糖低剂组、香菇多糖高剂组，每组7只动物。其中香菇多糖低剂组每天灌胃香菇多糖0.4 mg·g-1体质量，香菇多糖高剂组每天灌胃香菇多糖0.8 mg·g-1体质量，正常组和模型组以纯水代替。给药d 4，模型组和给药组腹腔注射环磷酰胺85 μg·g-1体质量，正常组用生理盐水对照，给药周期为7 d。

给药的d 2，各组小鼠的背部脱毛剂脱毛1 cm×1 cm，在脱毛后的d 2，脱毛区用0.44 mol·L-1丙酮20 μl涂抹致敏小鼠。在给药的d 7，各组小鼠的右耳用0.08 mol·L-1DNFB丙酮20 μl进行攻击，左耳用丙酮做对照。

1.4.1.2派氏结淋巴细胞比例和活化检测 攻击30 h后，脱颈椎处死小鼠，打开腹腔取出全段小肠，计数小肠派氏结的个数。取出3～4个派氏结，置于盛有冷PBS的无菌培养皿中。常规方法制备淋巴细胞悬液，调整细胞数至1×1010·L-1，APC-antimouse CD3，FITC-anti-mouse CD4 和 PE-anti-mouse CD8流式抗体检测T细胞比例和亚群变化;APC-anti-mouse CD3和PE-anti-mouse CD69流式抗体检测T细胞活化情况。

1.4.2香菇多糖对整体免疫系统的影响

1.4.2.2DTH实验 动物分组、给药和DTH模型建立同上。在DNFB丙酮攻击右耳廓30 h后，脱颈椎处死小鼠，剪下左右耳廓，打孔称重，计算耳肿胀度。

2 结果

2.1香菇多糖对系统免疫功能的影响腹腔注射85 μg·g-1体重环磷酰胺可以减轻小鼠胸腺质量，抑制PWM刺激的小鼠脾脏淋巴细胞的体外增殖及其迟发型超敏反应能力(P＜0.01或P＜0.05)，说明此剂量的环磷酰胺可以有效抑制小鼠系统免疫的正常功能。

与免疫抑制模型比较，香菇多糖组的小鼠胸腺指数虽然没有明显恢复，但均表现有一定程度的回升趋势。而香菇多糖对PWM刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖和迟发型超敏反应能力有明显改善作用(P＜0.01或P＜0.05)，并与剂量呈现正相关。说明香菇多糖对免疫抑制小鼠的整体免疫系统有正向调节作用。见Tab 1、2。

Tab 1 Effects of lentinan on thymus index of mice(±s，n=7)

Tab 1 Effects of lentinan on thymus index of mice(±s，n=7)

＊＊P＜0.01 vs normal

Group Thymus index Normal 35.76±6.09 Model 22.19±3.90＊＊LNT 400 mg·kg-1 25.54±2.72 LNT 800 mg·kg-125.45±5.22

Tab 2 Effects of lentinan on lymphocyte proliferation of spleen lymphocytes and delayed type hypersensitivity of mice(±s，n=7)

Tab 2 Effects of lentinan on lymphocyte proliferation of spleen lymphocytes and delayed type hypersensitivity of mice(±s，n=7)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model

Group Stimulation index Ear swelling/mg Normal 2.11±0.69 18.91±4.46 Model 1.14±0.25* 12.36±1.62＊＊LNT 400 mg·kg-1 1.59±0.26# 15.64±3.30 LNT 800 mg·kg-1 1.75±0.04## 17.63±4.66#

2.2香菇多糖对肠道黏膜免疫功能的影响腹腔注射85 μg·g-1环磷酰胺能明显升高派氏结中CD3+T淋巴细胞的比例，降低T淋巴细胞的正常活化水平，说明此剂量的环磷酰胺可以有效抑制小鼠的肠道黏膜免疫系统功能(P＜0.01或P＜0.05)。见 Tab 3、Fig 1、2。

Tab 3 Effects of lentinan on the proportion and activation of T lymphocytes in PPs of DTH mice(±s，n=7)

Tab 3 Effects of lentinan on the proportion and activation of T lymphocytes in PPs of DTH mice(±s，n=7)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs model

Group CD3+cells/% CD69+cells/%Normal 22.90±5.00 36.60±2.20 Model 56.66±7.99＊＊ 18.48±3.24*LNT 400 mg·kg-1 53.75±8.11 21.82±7.48 LNT 800 mg·kg-1 29.38±5.86## 33.58±9.47##

与免疫抑制模型比较，灌服香菇多糖的小鼠小肠派氏结中的CD3+T淋巴细胞的相对比例及其活化水平都表现出明显的恢复趋势，其中0.8 mg·g-1剂量组的小鼠派氏结T细胞比例和活化水平接近正常组(P＜0.01)。说明香菇多糖对免疫抑制小鼠的肠道黏膜免疫系统有正向调节作用。

3 讨论

人和动物的肠黏膜面积巨大，约2倍于皮肤的面积，每时每刻都接触大量的抗原，承担着重要的免疫功能，它是机体抗感染的第一道防线，也是机体感染的主要部位之一［6-7］。微生物学与传染病学家Montagne曾经说过“肠道内壁是人体最大的免疫器官”，由此可以看出肠道黏膜免疫系统在人体免疫系统中占据的重要地位。派氏结是存在于哺乳动物小肠段的集合淋巴小结，常沿肠系膜对侧分布，其中富含胸腺源性T细胞和B细胞，是肠道黏膜免疫系统的免疫诱导部位［8］。PP结是刺激sIgA分泌和诱导细胞增殖活化抵御肠道内有害物质侵袭的主要部位，PP结的大小、数量及其中淋巴细胞数量和活性状态等可以反映肠道黏膜局部的免疫状态［9-10］。

Fig 1Effects of lentinan on percentage of T cells in PPs of DTH mice(±s，n=7)

Fig 2Effects of lentinan on activation of T cells in PPs of DTH mice(±s，n=7)

香菇多糖对系统免疫功能的影响已经得到很多研究的证实，本实验中，通过PWM刺激小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖和小鼠迟发型超敏反应能力两方面，并结合小鼠体重增长趋势和胸腺指数观察香菇多糖对系统免疫功能的影响。结果显示，香菇多糖对环磷酰胺诱导的系统免疫抑制状态有改善和恢复作用。在确立香菇多糖对系统免疫的正向调节作用基础上，本实验在DTH模型小鼠上，通过肠道派氏结通过体外DNFB致敏、攻击，诱导机体产生强烈的细胞免疫应答，机体内的T淋巴细胞会因此而发生增殖活化等现象，以观察香菇多糖对免疫抑制小鼠肠道派氏结中T细胞的影响。在DTH模型基础上，前后PP结中T淋巴细胞比例、亚群及活化的变化情况，一方面可以观察香菇多糖是否能够增强机体淋巴细胞对外来抗原刺激敏感性，另一方面可以放大香菇多糖的免疫药效作用，便于结果的检测和统计分析。实验结果表明，香菇多糖对环磷酰胺诱导的PP结T、B淋巴细胞比例失衡，T淋巴细胞活化水平降低等肠道黏膜免疫紊乱状态有明显改善作用，对肠道黏膜免疫系统的功能具有正向调节的作用。

有学者通过口服与注射两种给药途径比较四君子复方总多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠溶血素生成和迟发型超敏反应的实验发现，口服给药途径的效果优于注射给药［11］。在本实验中，口服方式给予香菇多糖，小鼠的肠道黏膜免疫和系统免疫的紊乱和抑制状态均表现出相应改善，提示机体肠道黏膜免疫与系统免疫之间存在着某种联系。作为系统免疫的一个重要组成部分，肠道黏膜免疫系统局部的免疫反应可以通过淋巴细胞循环和归巢等机制影响到系统免疫，由此，肠道黏膜免疫系统很可能是香菇多糖发挥免疫药效的首要部位。

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