蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠海马LTP及氨基酸含量的影响

董晓华，张丹参，张 力，李 炜

(1.河北医科大学药学院，河北石家庄 050017;2.河北北方学院医学院药理学教研室，河北张家口 075000)

急性脑缺血可引起脑细胞损伤及严重的神经功能障碍，而恢复血流后，又可导致脑缺血/再灌注损伤，进一步产生一系列病理生理和生化的改变，并导致学习记忆障碍。蛇床子素(osthole，Ost)又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚，是从伞形科蛇床属植物蛇床的果实中提取的一种香豆素。具有抗炎、扩张血管、改善学习记忆、抗凝血、抑制血栓形成、调血脂和植物雌激素样作用［1］。另有报道Ost可通过抑制炎症反应及神经细胞凋亡对抗脑缺血/再灌注损伤［2］，但从突触传递活动及中枢Glu/GABA系统探讨Ost对脑缺血/再灌注损伤中学习记忆障碍影响的作用机制未见报道。本实验采用TTC染色法、Morris水迷宫法、在体细胞外记录麻醉大鼠海马齿状回突触传递活动的电生理学方法及高效液相色谱法，观察Ost对脑缺血/再灌注大鼠脑梗死体积、空间学习记忆障碍、海马齿状回(dentate gyrus，DG)高频刺激(high frequency stimulation，HFS)诱导的长时程增强(long-term potentiation，LTP)现象及海马内谷氨酸(glutamic acid，Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)含量的影响。

1 材料

1.1药品和试剂蛇床子素，南京泽朗医药科技有限公司，实验前用N，N二甲基甲酰胺溶解，吐温80助溶(N，N二甲基甲酰胺 ∶吐温80∶生理盐水=1∶1∶8)，使用前用生理盐水稀释至所需浓度;栓线，北京沙东生物技术有限公司，产品编号2432-100;谷氨酸、γ-氨基丁酸标准品由中国药品生物制品检定所提供。

1.2仪器VC-11记忆示波器(日本Nihon Konden)，SEN-7203三道电子刺激器(日本 Nihon Konden)，SS-202J刺激隔离器(日本 Nihon Konden)，江湾Ⅰ型-C脑立体定位仪，LTP生物信号采集处理系统2003，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)，高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.3动物SD(Sprague-Dawley)大鼠，♂，216只，体质量180 g～200 g，购自中国医学科学院动物繁育厂。

2 方法

2.1分组与给药动物随机分6组，每组36只，分别是正常组(Normal group)、假手术组(Sham-operated group)、模型组(Model group)、蛇床子素25.0mg·kg-1组(Ost A group)、蛇床子素12.5 mg·kg-1组(Ost B group)、尼莫地平 1.0 mg·kg-1组(Nim group)。各组均每天早晨腹腔注射(peritoneal injection，ip)给药1次，连续给药14d，正常组、假手术组、模型组给予等量的溶剂。

2.2动物模型制作d 6给药30 min后采用改进Longa线栓法［3］制备大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型。10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于恒温手术台上，于颈部行15 mm旁正中纵行切口，钝性分离右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)及颈外动脉(external carotid artery，ECA)。在ECA靠近颈内、外分叉约5 mm处剪一小切口，迅速将栓线(线长40 mm，线身直径0.24 mm，头端直径0.32 mm±0.02 mm)从ECA经过ICA插入大脑中动脉开口处前端(平均插入约20 mm±0.5 mm)，直到有轻微阻力感为止。2 h后提拉栓线直至退回ECA内，实现大脑中动脉再灌注。正常对照组不进行手术，假手术组将栓线送入ICA，但不入颅。

2.3脑梗死体积的测定再灌注后24 h进行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，按照文献方法［4］快速断头取脑，置冰箱(-20℃)内10 min达到适当硬度，切除嗅脑、小脑和低位脑干后，取冠状面从前向后连续等距离切取5个脑片，将脑片放于2%TTC染液37℃孵育30 min，4%多聚甲醛避光固定24 h。未受损的正常脑组织染色后呈红色，梗死组织不着色而呈白色，将白色组织仔细分离并称重，按以下公式计算脑梗死体积:脑梗死体积百分比/%=缺血部分重量/全脑重量×100%。

2.4Morris水迷宫实验再灌注后d 4开始进行水迷宫实验，每只动物连续训练4 d，每天训练2次，间隔15 min，每次所采用的入池位置为站台所对及相邻象限，每次训练3 min。动物找到并爬到站台后让其停留20 s，若入水后3 min内未能找到或爬上站台，则将其放置于站台上站立20 s，之后将动物从站台上取下休息，结果以大鼠寻找站台的时间即潜伏期表示。

2.5电生理学实验再灌注后d 8行电生理学实验，参照Pellegrino大鼠脑立体定位图谱中的定位方法，定位刺激电极和记录电极。诱发电位和HFS参数按照文献方法［5］。给予HFS后，如果群峰电位(PS)幅度较自身对照值增加30%以上且持续时间超过30 min，则表明LTP现象已形成。

2.6氨基酸含量测定分别于再灌后1、6、24、72 h断头取脑，冰盘中分离缺血侧海马，加入9倍体积的甲醇/水(V/V=1∶1)制成10%脑组织匀浆，以10 000r·min-1低温高速离心 10 min，留取上清-80℃保存。采用柱前衍生化高效液相色谱紫外检测法测定，取脑组织匀浆液 200 μl，加入 200 μl乙腈，混匀，低温高速离心除蛋白10 min(10 000 r·min-1)，取上清液加入 200 μl 0.5 mol·L-1碳酸氢钠和100 μl 0.5%2 ，4-二硝基氟苯，混匀，暗中衍生 1 h，水浴 60 ℃，进样 20 μl。

2.7统计学方法采用SPSS 17.0统计软件，所有数据均以±s表示，组间比较采用t检验。

3 结果

3.1蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠脑梗死体积的影响正常组和假手术组未发现梗死灶，模型组梗死体积是43% ±11%，与假手术组比较明显增大(P＜0.01)，而蛇床子素 25.0 mg·kg-1组、12.5 mg·kg-1组及尼莫地平组与模型组相比梗死体积明显缩小，结果见 Fig 1A，1B。

3.2蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠Morris水迷宫实验潜伏期的影响如Tab 1所示，随着训练天数的增加，各实验组潜伏期均不断缩短;实验d 1各组间潜伏期相比差异无显著性(P＞0.05);模型组与假手术组相比，训练d 2开始，潜伏期延长(P＜0.05)，到d 4差异有显著性(P＜0.01);蛇床子素25.0 mg·kg-1组与模型组相比，从d 2开始，潜伏期明显缩短 (P＜0.05)，d 3～d 4有显著性差异(P＜0.01);蛇床子素12.5 mg·kg-1组与模型组相比d 4潜伏期明显缩短 (P＜0.05);尼莫地平组与模型组相比，潜伏期从d 3开始缩短(P＜0.05);假手术组与正常组比较无差异，说明单纯手术操作对大鼠Morris水迷宫结果无影响。

Tab 1 Effects of osthole on the latency in Morris water maze test in cerebral ischemia-reperfusion rats(x¯±s，n=6)

3.3蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠海马DG HFS诱导LTP的影响结果见Fig 2，各组在给予HFS后，群峰电位(population spike，PS)幅值明显增大并维持，在观察的60 min内无明显减弱;模型组在HFS后PS幅值增加，但各时间点与假手术组相比，PS幅值增加幅度减少(P＜0.05);蛇床子素A组(25.0 mg·kg-1)在HFS后，10 min时PS幅值即开始升高，与模型组相比差异有显著性(P＜0.01)，30 min开始与模型组相比P＜0.05;蛇床子素 B组(12.5 mg·kg-1)在HFS后，10 min时PS幅值即开始升高，与模型组相比升高(P＜0.05);尼莫地平组与模型组比较PS幅值明显升高;假手术组与正常组相比PS幅值无差异，说明手术操作对大鼠LTP无影响，结果见Fig 2。

Fig 1 Effects of osthole on the infarct volume in cerebral ischemiareperfusion rats(±s，n=6)

Fig 2 Effects of osthole on LTP induced by HFS in the DG of hippocampus in cerebral ischemia-reperfusion rats(±s，n=6)

3.4蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠海马氨基酸含量的影响

3.4.1蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠海马Glu含量的影响由Tab 2可以看出，与假手术组相比，模型组海马 Glu含量再灌注24 h内，均升高(P＜0.05)，于72 h恢复正常;与模型组相比，蛇床子素25.0 mg·kg-1组Glu含量在各个时间点降低(P＜0.05)，蛇床子素12.5 mg·kg-1组在再灌注1 h，6 h Glu含量均降低 (P＜0.05)，72 h基本恢复正常;尼莫地平组与模型组相比各时间点Glu含量明显降低;假手术组与正常组比较无差异，说明手术操作对海马Glu含量无影响。

Tab 2 Effects of osthole on the contents of Glu in hippocampus of cerebral ischemia-reperfusion rats(x¯±s，n=6)

3.4.2蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠海马GABA含量的影响由Tab 3可以看出，与假手术组相比，再灌注后24 h内模型组GABA含量升高(P＜0.05)，72 h基本恢复正常;与模型组相比，蛇床子素25.0 mg·kg-1组再灌后1 h海马GABA含量降低(P＜0.05)，72 h升高(P＜0.05);蛇床子素12.5 mg·kg-1组与模型组相比再灌注1 h海马GABA含量下降(P＜0.05);尼莫地平组与模型组相比1 h和6 h降低(P＜0.01)，72升高(P＜0.05);假手术组与正常组比较无差异，说明手术操作对海马GABA含量无影响。

Tab 3 Effects of osthole on the contents of GABA in hippocampus of cerebral ischemia-reperfusion rats(¯x ± s，n=6)

4 讨论

本实验利用大鼠大脑中动脉栓塞模型，模拟临床上局部脑缺血/再灌注过程，发现在缺血前5 d给予蛇床子素后，可明显缩小大鼠脑缺血的梗死体积，说明蛇床子素对脑缺血/再灌注损伤具有神经保护作用。在Morris水迷宫实验中观察到蛇床子素可明显缩短寻找站台的潜伏期，改善缺血/再灌注大鼠空间学习记忆障碍。海马是学习记忆过程中起关键作用的中枢结构，LTP是海马突触可塑性的重要形式，是学习记忆的神经细胞学基础［6］，因此我们利用电生理学实验观察蛇床子素对LTP的影响，结果表明蛇床子素(25.0、12.5mg·kg-1)对脑缺血/再灌注大鼠海马齿状回HFS诱导的LTP有增强作用，且在观察的60 min内无明显减弱，这与其促进学习记忆的行为学实验结果一致，即从整体和细胞水平证实蛇床子素对脑缺血/再灌注损伤引起的学习记忆障碍有改善作用。

本实验对缺血/再灌注后不同时间点海马内Glu和GABA水平进行了比较分析，结果显示模型组大鼠两种氨基酸的变化时相基本一致，再灌注后水平开始升高，在1 h时最高，持续24 h，然后逐渐下降，再灌注72 h时基本恢复正常;蛇床子素可以降低缺血/再灌注后72 h内谷氨酸含量，而对于GABA含量蛇床子素25.0 mg·kg-1呈现一种先降低后升高的趋势，且在同一时间点随着蛇床子素剂量的增加GABA降低幅度越小，如蛇床子素25.0 mg·kg-1组和12.5 mg·kg-1组在6 h时分别降低13%和18%，24 h分别降低15%和20%，表明蛇床子素(25.0 mg·kg-1)可通过降低Glu含量、提高GABA的含量，影响中枢Glu/GABA学习记忆调节系统。中枢Glu/GABA学习记忆调节系统是继胆碱能神经之后神经递质调控学习功能的一种新理论。在脑缺血损伤后，Glu大量释放激活NMDA受体，引起细胞内Ca2+超载，并最终引起神经细胞代谢和功能障碍及死亡［7］，同时可造成海马区域内病理性的LTP及以后的信息传递障碍，形成学习记忆缺陷［8］。而GABA可通过突触后膜超极化，减少Ca2+内流，突触前抑制降低Glu释放，从而对抗Glu兴奋性毒性作用［9］。我们的研究表明蛇床子素可减弱缺血/再灌注后Glu诱导的病理级联反应并通过升高GABA含量对抗Glu引起的兴奋性毒性，发挥脑保护作用。这可能是其改善大鼠学习记忆障碍，增强海马LTP，发挥缺血/再灌注损伤保护作用的机制之一。

祖国传统医药在治疗缺血性脑血管病方面有较大潜力，越来越多的植物药在脑缺血/再灌注损伤中作用得到研究和应用。蛇床子素作为有效成分之一在心血管系统、中枢神经系统、免疫系统广泛应用，其毒副作用较小。研究表明蛇床子素通过抗炎和抗氧化机制而抗脑缺血损伤［2］，我们的实验进一步证实蛇床子素调节中枢Glu/GABA系统而具有改善脑缺血/再灌注后的学习记忆障碍作用，因此蛇床子素在对脑缺血/再灌注损伤的防治作用将是多靶点、多层次、多方位的，较其他植物药更具有潜力和优势。另外蛇床子素具有脑组织靶向性，透过血-脑屏障［10］，这为其治疗缺血性脑血管病奠定药动学基础。总之，对蛇床子素在脑缺血/再灌注损伤中作用的进一步研究，在老龄化社会的今天，具有广阔的前景和实用价值。

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