“芩部丹”中三种单体对结核分枝杆菌作用下TLR2表达的影响

王莉新，吴燕燕，王 易

(上海中医药大学免疫学与病原生物学教研室，上海 201203)

中医临床验方“芩部丹”(由黄芩、百部、丹参组方)系上海市龙华医院邵长荣医生创立的抗痨方药。据已有资料显示，“芩部丹”作为医院制剂用于治疗对抗结核化疗药物产生耐药性的开放性肺结核患者，痰菌阴转率可高达47%;治疗难治性肺结核患者，痰菌阴转率可达34.5%，均见较明显的临床疗效［1］。

但此方除方中黄芩被证实具有一定的抑制结核杆菌生长作用外，其抗痨作用机制始终未能阐明。近年研究发现，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)通过对病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)的识别而在固有免疫中发挥主导作用。已有研究表明这类受体在结核分枝杆菌入胞以及入胞后的转归中起重要作用［2］。其中TLR2与结核分枝杆菌入胞过程的关系尤为密切。故此实验研究设想，“芩部丹”临床药效的发挥，可能与其所含成分对TLR2受体在宿主细胞上之表达有关。此实验选取目前国内可获取之黄芩、百部、丹参的主要提取物黄芩苷(baicalin)、对叶百部碱(tuberostemonine)、丹参多酚酸盐(salvianolate)作为研究对象，以观察这些成分对TLR2的影响作用，揭示“芩部丹”可能的抗结核免疫药理作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞及细菌人单核-巨噬细胞系U937，由上海交通大学医学院免疫研究所惠赠;结核分枝杆菌H37Ra，由上海复旦大学遗传学研究所惠赠。

1.1.2药物单体及主要试剂黄芩苷、对叶百部碱单体购自上海同田生物技术有限公司;注射用丹参多酚酸盐由上海绿谷制药有限公司提供，100 mg·瓶-1;RPMI 1640培养基和胎牛血清均购自Gibco公司;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)购自Promega公司;TRIzol reagent购自 Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit和 SYBR Premix Ex TaqTM均购自TaKaRa公司;PCR引物序列通过Oligo6软件设计，并由生工生物工程(上海)有限公司合成;Anti-Human TLR2 FITC及对应的同型对照购自eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1细菌培养用含体积分数为0.10的ADC 7H9培养液，在37℃恒温培养箱中培养，每周观察1次，一般1～2周可见瓶底有颗粒生长，10～15 d达到对数生长期。取对数生长期细菌用含有体积分数为0.10的胎牛血清RPMI 1640培养液重悬，调整浓度为 1 ×108·L-1。

1.2.2细胞培养U937细胞按常规方法用含有体积分数为0.10的胎牛血清RPMI 1640培养液，在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。将U937细胞密度调整为5×108·L-1，经终浓度为100 nmol·L-1PMA刺激48 h后，分化为巨噬细胞(以镜下细胞形态为确定依据)。弃去培养液，重新调整细胞密度为1×109·L-1，2 ml/孔铺于6孔板中，设对照组(Control)、模型组(Model)、黄芩苷组(Baicalin)、对叶百部碱组(Tuberostemonine)、丹参多酚酸盐组(Salvianolate)5组，每组3复孔。

1.2.3细胞感染模型的制备及药物干预细胞和细菌按照上述方法培养后，于模型组及用药组中，按照细胞∶细菌=10∶1加入细菌，将两者共培养24 h，建立细胞感染模型。两者共培养24 h后，换液，其中黄芩苷组、对叶百部碱组、丹参多酚酸盐组换用含药(终浓度为10 mg·L-1)的完全培养液继续培养。待药物作用8 h和24 h后，收集细胞，分别进行相关指标检测。

1.2.4TLR2 mRNA表达水平检测收集药物作用8 h后细胞，常规提取细胞总RNA。取细胞总RNA 5 μg，按逆转录试剂盒说明将其逆转录为cDNA。以GAPDH为内参，分别进行荧光定量PCR反应。引物序列如下:TLR2(F:CTGGCCAAAGTCTTGATTGAT，R:GACATTCCGACACCGAGAG);GAPDH(F:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R:GGTGCTAAGCAG TTGGTGGT)。反应条件为:95℃预变性30 s，1个循环;95℃变性5 s，60℃ 退火20 s，共40个循环。用Rotor-Gene 6.0.38软件读取各个样本的Ct值，结果以 2-ΔΔCt值表示。

1.2.5TLR2蛋白表达水平检测收集药物作用24 h后细胞，以FACS法检测TLR2蛋白表达水平。按照说明书加入适量Anti-Human TLR2，避光孵育30 min后，PBS洗两次，以 200 μl含体积分数为0.02多聚甲醛的PBS重悬细胞。于BD公司流式细胞仪上进行检测并读取数据。

1.3统计学分析所有数据均以±s来表示，应用SPSS13.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1“芩部丹”对TLR2 mRNA表达的影响实验结果显示，与对照组相比，模型组TLR2的mRNA表达水平降低(P＜0.05);与模型组相比，黄芩苷组、对叶百部碱组、丹参多酚酸盐组TLR2的mRNA表达水平均增高(P＜0.05)。提示黄芩苷、对叶百部碱、丹参多酚酸盐均可以纠正因结核分枝杆菌感染所造成之TLR2 mRNA表达下调的现象。见Fig 1，2。

Fig 1 The mRNA expression of TLR2 in U937

2.2“芩部丹”对TLR2蛋白表达的影响实验结果显示，与对照组相比，模型组TLR2的蛋白表达水平降低(P＜0.05);与模型组相比，黄芩苷组、对叶百部碱组、丹参多酚酸盐组TLR2的蛋白表达水平均增高(P＜0.05)。提示黄芩苷、对叶百部碱、丹参多酚酸盐均可以纠正因结核分枝杆菌感染所造成之TLR2蛋白表达下调的现象。见Fig 3，4。

Fig 2 The amplification curve of TLR2 by RT-QPCR

Fig 3 The protein expression of TLR2 in U937

以上研究结果均提示，“芩部丹”中3种单体黄芩苷、对叶百部碱、丹参多酚酸盐的临床抗结核疗效，有可能与其提高巨噬细胞表面受体TLR2表达的作用相关联。

3 讨论

自1994年发现人类TLRs以来，TLRs因其对病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的识别作用和介导多种免疫细胞激活的生物学效应，日益受到免疫学界的关注。并对其机制进行了较深入的研究。此外也发现了相当数量的药物，尤其是中药成分(多糖、黄酮、三环二萜类)对TLRs的表达具有调节作用［3］。这也促成了以TLRs为靶点治疗感染性、免疫性疾病观点的形成。TLR2与结核分枝杆菌入胞关系密切，并可识别结核分枝杆菌表面的阿拉伯糖甘露糖脂和磷脂酰肌醇甘露聚糖等，进而激活抗原提呈，调节固有免疫及适应性免疫［4-7］。有研究发现［8］，敲除小鼠 TLR2基因，然后让小鼠感染结核分枝杆菌，结果发现在感染2 h内，中性粒细胞浸润明显减少，并且IL-6、TNF和IL-12 p40分泌亦下降，说明小鼠对结核分枝杆菌的易感性增加。同时，Harding等［9］发现结核分枝杆菌表面脂蛋白LpqH、LprG及LprA可与巨噬细胞表面TLR2结合，从而抑制APC MHCⅡ类分子表达，令APC提呈抗原的能力下降，使结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活下来。这些现象均表明，TLR2在结核感染过程中起到了非常重要的作用。

Fig 4 The protein expression of TLR2 by FACS

王莉新等［10］在前期研究中发现丹参多酚酸盐对人巨噬细胞表面的模式识别分子产生调节作用，而黄芩苷化学结构亦属于能够对固有免疫与炎症反应产生调节作用的黄酮类。考虑到这些已观察到或已被文献报道的药效作用，推论所选取的芩部丹单体黄芩苷、丹参多酚酸盐有可能影响人巨噬细胞TLR2的表达。出于同一推论，此实验亦曾对丹参酮ⅡA进行相同研究，结果未发现对TLR2表达的影响。此实验研究还显示黄芩苷可直接提高人巨噬细胞TLR2的表达(结果另文发表)，而丹参多酚酸盐与对叶百部碱仅表现为可拮抗因结核分枝杆菌感染所造成之TLR2蛋白表达下调现象。提示此二者真正的作用部位可能是巨噬细胞内对TLR2表达的负反馈调节通路，今后将继续就此开展深入研究。

中药提取物用作体外细胞水平的药效研究，其剂量确定是一个公认的难题，因为细胞培养液中所添加的药物含量很难对应于临床给药剂量，本实验参照抗肿瘤药物敏感性试验的相关文献［11］。将单体含量按估算设置于临床生药用量范围之内，采用可观察到阳性结果的最低用药量(因在不同提取物浓度作用条件下，靶细胞所测数据未呈现典型剂量-反应曲线)。其显示的结果仅表明在设定实验条件下，所选用的中药单体可对人巨噬细胞表面TLR2的表达产生影响。同时，因尚未发现可引起类似生物学作用的合适化合物，故实验未能设置阳性对照，但这并不影响实验结果观察的客观性。

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