合成棕点湍蛙抗菌肽的抗菌活性评价

赵铁华，程玉洁，李 哲

(河北师范大学药物研究所，河北石家庄 050016)

棕点湍蛙抗菌肽是2006年河北师范大学刘敬泽教授从我国西南地区特产棕点湍蛙皮肤分泌液中分离取得的一种分子量为1706.96 u的单链多肽，氨基酸序列为Phe-Leu-Pro-Pro-Ser-Pro-Trp-Lys-Glu-Thr-Phe-Arg-Thr-Thr，具有明显的抗菌活性，已经获得国家发明专利保护［1］。为了探讨合成抗菌肽与天然产物的一致性，为棕点湍蛙抗菌肽的应用和进一步的结构改造设计提供依据，本实验进行了合成抗菌肽的初步活性分析。

1 材料与方法

1.1受试药物合成棕点湍蛙抗菌肽:本实验室Fmoc固相法合成;RP-HPLC分析纯度为质量分数0.977;MS鉴定分子量1706.96 u，与预期相符。

硫酸庆大霉素注射液:石药集团欧意药业有限公司生产，批号:068100435。青霉素注射液:天津药业集团新郑股份有限公司生产，批号:201009070。硫酸链霉素注射液:乐山三九长征药业股份有限公司生产，批号:20100610。

1.2抗菌活性测定

1.2.1培养基的配制营养肉汤培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)15.2 g，加入400 ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，4℃保存备用。营养琼脂培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)16 g，加入400 ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，取15 ml灭菌培养基加至无菌培养皿，加盖冷却后制成琼脂平板培养基，倒置，4℃保存备用。

1.2.2受试药液的配制

1.2.2.1合成抗菌肽的配制 精密称定合成抗菌肽400 μg，溶于 1 ml无菌注射用水，NaHCO3溶液(质量分数0.056)调 pH 为7～8，过孔径0.22 μm微孔滤膜，4℃保存待用。

1.2.2.2抗生素的配制 精密称取硫酸庆大霉素、青霉素、链霉素各10 μg，分别溶于1 ml无菌注射用水中，调pH为7～8，备用。

1.2.2.3合成抗菌肽与抗生素混合液的配制 精密称取硫酸庆大霉素、青霉素、链霉素各5 μg，分别加入合成抗菌肽100 μg，溶于1 ml无菌注射用水，NaHCO3溶液(质量分数0.056)调pH为7～8，过孔径0.22 μm微孔滤膜，4℃保存待用。

1.2.3试验菌液的配制金黄色葡萄球菌(2株，菌号分别为26001/26、26002/6，中国药品生物制品检定所提供)和大肠埃希菌(2株，菌号分别为44102/2a3、44113/10，中国药品生物制品检定所提供)分别以肉汤培养基37℃18 h增菌，相同培养基10-3稀释为实验菌液。

1.2.4受试药物对各试验菌株最小杀菌浓度(MBC)的测定［2］分别取各受试药液以营养肉汤培养基倍比稀释至10个对倍稀释浓度，每稀释度药液1 ml(各2个复孔)加至24孔细胞培养板，每孔加入对应试验菌液50 μl，另设菌液和培养基对照孔。24孔板置37℃培养箱，18 h后观察。取未见细菌生长各孔培养物50 μl，均匀涂至营养琼脂平板培养基表面，平板倒置，37℃培养18 h后观察。以菌落数少于5个(2个复孔的平均值)的药物最高稀释度为药物对该细菌的最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果

Tab 1结果显示，合成抗菌肽对所试金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有一定的杀菌作用，MBC值分别为200 mg·L-1和100 mg·L-1;庆大霉素、青霉素和链霉素对所试菌株杀菌作用较强，MBC值分别为1.25 mg·L-1至5 mg·L-1;合成抗菌肽与青霉素、链霉素联合使用后抗菌作用增强，其中与青霉素联合使用的效果明显，对金黄色葡萄球菌的MBC值达到青霉素/合成肽 0.625 mg·L-1/25 mg·L-1。

3 讨论

抗菌肽是一类以肽键为骨架结构，具有广谱抗菌作用，广泛分布的天然活性产物，具有结构新颖、活性高、耐药性发生几率小等多种优点［3］。无尾两栖动物经长期进化，皮肤分泌液产生大量抵御所处环境病原微生物的天然活性短肽，是抗菌肽的重要天然产物库［4］。其中棕点湍蛙抗菌肽由于结构简单，药理作用明显，有可能作为前体化合物或直接开发为针对病原微生物感染的治疗药物［1］。

人工合成是解决棕点湍蛙抗菌肽天然资源来源和提取纯化困难及其较高成本问题的有效方法之一。本实验采用Fmoc固相方法合成了棕点湍蛙抗菌肽并进行了初步活性分析，结果显示，单纯使用合成产物的抗菌活性明显低于天然产物(对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MBC值分别为23.1 mg·L-1和 4.3 mg·L-1)［1］。目前认为，氨基酸序列、空间构型，以及与此密切相关的阳离子和两亲特性是影响包括棕点湍蛙抗菌肽在内的阳离子抗菌肽活性的主要因素［5］。本实验经HPLC和MS鉴定，合成抗菌肽与生物化学提取的天然产物一级结构相同。人工合成抗菌肽与天然产物比较活性的部分丧失是否与其空间构型的改变有关尚需进一步探讨。在构效关系分析基础上进行进一步的结构设计改造应该是保持甚至提高合成棕点湍蛙抗菌肽活性的必要工作。

在分析抗菌肽与经典抗生素作用机制基础上，根据资料研究的提示［6］，本文进行了合成抗菌肽与经典抗生素的联合应用实验，结果表明，合成抗菌肽与青霉素、链霉素联合使用后抗菌作用具有增强趋势，其中与青霉素联合使用效果较明显。

Tab 1 The results of MBC about palm point turbulent frog antimicrobial peptides joint with traditional antibiotics(mg·L-1)

抗生素的作用机制主要是与细菌细胞膜或胞内特异受体结合，其中青霉素主要作用于革兰染色阳性细菌，通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成。由于经典抗生素作用靶受体的限制，细菌很容易通过变异而产生耐药性。资料表明，北京地区2005～2008年临床监测金黄色葡萄球菌对含青霉素在内的所有β-内酰胺类抗生素临床耐药［7］。

抗菌肽主要作用机制与传统的经典抗生素有较大差异。根据现有研究资料，抗菌肽主要通过其特有的阳离子型两亲α-螺旋或β-折叠结构作用在细菌的细胞膜上，破坏膜电势，引起细胞质外泄［5］。作用机制分析，本实验抗菌肽与经典抗生素的联合应用实验显示的抗菌作用增强趋势，可能是抗菌肽首先作用于细菌细胞膜上，增加膜的通透性，再由经典抗生素与特异性靶受体作用，进而增强抗菌肽和经典抗生素单独使用的疗效。由于抗菌肽不涉及与细菌等病原微生物特异性受体的结合，较少产生耐药性［5］，本试验采用的抗生素联合应用方案可能有助于改善病原性细菌对传统抗生素的耐药性。

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