自由活动小鼠颅内脑电记录在热性惊厥研究中的应用

孔维麟，范元腾，李 亮，彭碧文

(武汉大学基础医学院生理学系，湖北武汉 430071)

脑电图(electroencephalogram，EEG)是用现代电子放大技术，从放置在头皮上的电极描记出脑神经细胞的自发生物电活动，通过脑电图仪加以放大后记录的脑电波形［1］。脑电图检查除能发现脑器质性病变外，主要反映脑神经细胞的电生理功能。EEG不论是在基础还是临床研究中，都具有重要的地位。目前专门记录EEG的实验仪器价格昂贵，难以广泛应用于神经科学相关研究，因此需要一种稳定可靠且简便易行的方法来描记EEG。我们经过长时间的反复实验，用一种目前实验室广泛使用的多通道国产仪器，建立了在清醒状态下小鼠颅内EEG的描记方法，为以后的实验研究提供简便、稳定可靠的实验方案。

1 材料与方法

1.1主要仪器材料RM6240BD生物信号采集处理系统(成都仪器厂)，自制的植入电极，连接导线，江湾脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)，青霉素(华北制药股份有限公司)，STRONG102型颅骨钻(韩国SAESHIN公司)，玻璃离子体水门汀(上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂)。

1.2实验动物成年C57BL6J小鼠(70 d龄)30只，♀♂不限，体质量30～36 g，由武汉大学动物实验中心提供［SCXK(鄂)2008-0004］。

1.3实验方法

1.3.1电极制备及检测将不锈细钢丝(直径0.08 mm)在接插件(规格0.3 mm)的一端紧密缠绕5～6圈，把钢丝与接插件锡焊连接牢固，剪断钢丝，留约5 mm于电极植入端，埋置电极时再根据实际需要剪成相应长度(Fig 1A)。利用接插件制作电极的优点是可直接购买获得，操作简单、拆卸方便，记录时只需与配套的接插件连接即可。将自制好的电极植入端用绝缘油漆浸润，经处理后保证植入端能够与周围组织绝缘，仅尖端部分能导电。制作好的电极用检流计检测是否绝缘和导电。

Fig 1 Hand-made implanted electrode and mouse with implanted electrodes

1.3.2埋植电极用紫外光消毒手术区域约30 min，后续电极植入手术都在无菌环境中进行。取成年小鼠用氨基甲酸乙酯(20%，1 g·kg-1体重)麻醉完全后，应用脑立体定位仪固定小鼠，保持头部水平。剪去头部鼠毛，划开头部皮肤约1.5 cm，分离皮下组织，剥离刮掉骨膜，暴露颅骨;找到人字缝(lambdoidal suture)，于前囟点(bregma)向后 X=2.30 mm，矢状缝(sagittal suture)旁Y=2.10 mm，硬膜下Z=2.0 mm定位海马［2-3］，给予碘伏消毒处理，用颅骨钻钻孔，将自制电极经消毒后植入海马;用调好的玻璃离子体水门汀把电极固定于颅骨(Fig 1B)。手术后恢复1周进行脑电图记录［4］。

1.3.3描记脑电图将导线连接小鼠海马左右植入电极的头外端与信号采集系统，用银针改制的勾形针状电极放置颈部皮下作为参考电极。小鼠处于自由活动状态，连接导线记录深部脑电图，以作分析处理使用。

1.3.4小鼠热性惊厥与癫痫的诱导

1.3.4.1热性惊厥模型 采用气浴方法建立热性惊厥模型［5-7］。

1.3.4.2青霉素诱导癫痫 小鼠以300万U·kg-1青霉素腹腔注射致痫。

1.4脑电图频段分类RM6240BD生物信号采集处理系统是根据EEG频率分为δ、θ、α、β 4个频段，本实验结果系统将自动划分为δ(1～4 Hz)，θ(4～8 Hz)，α(8～14 Hz)，β(14～30 Hz)，每30 s分析1次。

1.5统计学处理利用系统自带的分析软件对不同频段的脑电图进行分析，以得到脑电图各个频段的比例，结果输出为Excel表并做出线图。所有数据均以±s表示，两样本均数的比较采用t检验进行统计分析。

2 结果

2.1正常自由活动状态下小鼠的EEG正常清醒状态下自由活动的小鼠深部脑电图以δ波为主(约40.9%，n=10)，平均波幅为(68.3±1.1)μV(n=10)，无痫样放电;基础波稳定，节律整齐。正常自由活动状态下的小鼠深部脑电图频段分布变化较小且表现平稳，而皮层脑电图由于小鼠的活动而受到不同程度的影响，记录到干扰极大的伪迹(Fig 2)。

2.2小鼠热性惊厥及癫痫发作时的脑电图根据本实验室在热性惊厥的实验研究中，我们用气浴成功诱导热性惊厥模型，结合小鼠在行为学上惊厥发作时的分级，我们观察到小鼠在未发作惊厥时深部脑电图无异常波形，在惊厥发作时伴有异常放电。波幅在基础波上增高至(210.4±4.1)μV(n=10)，与正常小鼠脑电波幅差异有显著性(P＜0.01)，且频率增快，并偶有棘波、尖波，异常放电呈瞬时、间断性不规律放电(Fig 3A，B)。

腹腔注射青霉素诱导小鼠癫痫，可观察到癫痫发作时小鼠深部脑电呈现爆发性高波幅节律性棘波或棘慢波，在基础波上有明显的异常放电，波幅增高至(237.2±5.5)μV(n=10)，与正常小鼠脑电波幅差异有显著性(P＜0.01)，多见持续性节律性棘波、棘慢波或高波幅慢波(Fig 3C)。

Fig 2 EEG recording in hippocampus and cortex on freely moving mouse

Fig 3 Typical intracranial EEG on freely moving mice and their frequency distribution

从实验结果可以看出，在小鼠海马的深部脑电图中，δ波成分在各种状态下分布最为广泛。通过观察可以发现，EEG的波动随着惊厥或癫痫发作而出现相应的变化。行为学和EEG动态表现为:开始须动、咀嚼、耳朵抽动及阵挛，接着出现面部阵挛、节律性点头，然后是单肢阵挛，此时脑电活动表现间歇出现高波幅的棘慢波，而且频率是逐渐增高;达到Ⅳ—V级的全面性发作，双前肢对称性阵挛、后肢强直而坐立时，高波幅的棘慢波数量增多，且呈阵发节律出现;最后四肢强直阵挛、倒地而四肢朝上、或跳跃或翻，棘慢波变宽，波幅增高数量开始逐渐减少。根据Jung等［8］研究结果显示，海马区域置入电极描记大鼠癫痫发作时脑电图呈高振幅(＞2×baseline)，高频率 (＞8 Hz)放电，并跟行为学观察相一致;同样，Chu等［9］在实验中也得出相似的结果。

3 讨论

本实验的结果表明，通过植入电极结合RM6240BD信号采集处理系统描记小鼠自由活动状态下的深部脑电，具有很好的抗干扰效果，同时也避免了由于在活动状态下小鼠记录电极相对位置的改变而引起的脑电图记录的误差，这为其他脑电图的实验探究提供很好的方法和技术参考。为进一步验证植入电极描记脑电图的稳定性，我们制作了气浴诱导小鼠惊厥模型、青霉素诱导小鼠癫痫模型，通过描记惊厥、癫痫发作时脑电图的改变，结合小鼠行为学的表现，我们发现，植入电极可以很好地固定电极相对位置，为实验提供一个稳定可靠的记录方法;同时，用处死小鼠描记深部脑电图作为阴性对照，更进一步证实该信号采集系统良好的抗干扰功能。

另外，不论是在正常清醒状态，还是在惊厥或癫痫发作状态下，小鼠脑电图的频段主要分布在δ波，这与人的脑电图频段分布有明显的不同，正常成年人在睁眼或紧张状态下脑电图以β波为主，在额叶和顶叶最为明显［10］。改变植入电极的位置，其EEG波形仍然以δ波为主。其可能的原因是:人的EEG是在光线和室温适中、安静闭目等主动配合状态下进行，大脑皮质放电不受声、光、热、冷等外来干扰，此时的EEG所反映的是检查者大脑皮质安静状态下的放电。而小鼠除种属差异外，由于头部植入电极，放在一个陌生和有人为干扰的环境，不免紧张、不能主动闭眼等，因此，伪差因素较多，与人差别较大。

在实验操作过程中，为提高实验准确性，各步操作必须严谨，尤其在植入电极时，需先验证植入电极位置是否正确，取植入电极的尖端组织进行组织学验证是否为海马组织。在连接导线的过程中，做好电磁波的屏蔽，接好地线，把外界干扰尽可能的排除;描记EEG时，减少人员的走动，营造一个安静舒适的环境，让小鼠尽量处于自然的状态。在实验数据处理中，使用统一标准，在选择数据处理过程中尽量避免伪差的选入，确保每份数据的真实性。

通过我们对清醒状态下描记的正常EEG与麻醉状态下的EEG相比，我们发现，清醒状态下描记的EEG跟麻醉状态下的一样稳定，不受小鼠活动的影响或是干扰，在癫痫发作时也能保持稳定的描记状态，证实植入电极结合RM6240信号采集处理系统描记深部脑电可作为实验研究的一个有效方法加以推广。

［1］贾建平.脑电图［J］.现代电生理学杂志，2008，15(1):45-63.

［1］Jia J P.EEG［J］.J Modern Electrophysiol，2008，15(1):45-63.

［2］池志宏，王占友.锌离子及ZNT3在匹罗卡品癫痫模型小鼠海马分布和表达的研究［D］.中国医科大学学位论文，2008:8.

［2］Chi Z H，Wang Z Y.Localization and expression of Zn2+and ZNT3 in pilocarpine epileptic mouse hippocampus［D］.J Chin Med Univ，2008:8.

［3］王革平，吴馥梅，秦国强，等.小鼠海马微注射技术及其初步应用［J］.中国药理学通报，1993，9(1):73-4.

［3］Wang G P，Wu F M，Qin G Q，et al.Preliminary application of micro-injection into hippocampus in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，1993，9(1):73-4.

［4］Ates N，Akman O，Karson A.The effect of the immature rat model of febrile seizures on the occurrence of later generalized tonicclonic and absence epilepsy［J］.Brain Res Dev，2005，154(1):137-40.

［5］Gonzalez-Ramirez M，Salgado-Ceballos H，Orozco-Suarez S A，et al.Hyperthermic seizures and hyperthermia in immature rats modify the subsequent pentylenetetrazole-induced seizures［J］.Seizure，2009，18(7):533-6.

［6］Dubé C M，Brewster A L，Baram T Z.Febrile seizures:Mechanisms and relationship to epilepsy［J］.Brain Dev，2009，31(5):366-71.

［7］袁晓冉，彭碧文.惊厥相关动物模型的研究进展［J］.卒中与神经疾病，2010，17(5):312-4.

［7］Yuan X R，Peng B W.Research progresses on seizure-related animal models［J］.Stroke Nervous Dis，2010，17(5):312-4.

［8］Jung K H，Chu K，Lee S T，et al.Molecular alterations underlying epileptogenesis after prolonged febrile seizure and modulation by erythropoietin［J］.Epilepsia，2011，52(3):541-50.

［9］Chu K，Jung K H，Lee S T，et al.Erythropoietin reduces epileptogenic processes following status epilepticus［J］.Epilepsia，2008，49:1723-32.

［10］姚 泰.生理学［M］，北京:人民卫生出版社，2005:500.

［10］Yao T.Physiology［M］.Beijing:People’s Medical Publishing House，2005:500.