姜黄素对LPS诱导小鼠caeVEGF表达的抑制

甘 力，蒋福升，范秋艳，周 洋，林瑶瑶，阮 润，丁志山

(浙江中医药大学生命科学学院，浙江杭州 310053)

研究者认为，肿瘤的生长、侵袭和转移特征依赖于生成的血管为其提供氧气和营养物质，没有血管的生成，肿瘤最大也只能长至直径约1～2 mm大小［1］。为此，早在 1971 年，Folkman 等［2］就提出了可通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长及转移。至今，肿瘤血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤靶点。

其中，VEGF是诱导和促进血管生成最强有力的关键因子，也是抗血管生成的重要靶点;肿瘤组织往往过量表达VEGF因子，该因子可以与血管内皮细胞表面VEGF受体特异性结合，活化其包内酪氨酸激酶，并最终促进血管内皮细胞增殖和游走，构成血管样结构［3］。

研究表明，肿瘤部位VEGF的过量表达往往是因为各类癌基因及抑癌基因突变或因瘤组织缺氧、瘤内压力变化及酸中毒等微环境变化等因素诱发所致。而这些诱因往往需要相应的诱导因子与VEGF顺式作用元件上的特异序列相互作用才能启动VEGF过量表达;此外，正常组织往往不存在这些诱因，因此，本文立足“疾病之根本”，模拟瘤组织微环境，以VEGF顺式作用元件为对象，EGFP为报告基因，构建表达载体，转染HeLa细胞，结合荧光显微技术及流式细胞仪分析，建立抗血管药物筛选平台;所筛选的药物有望从根本上纠正VEGF过量表达问题，从而起到抗血管异常增生作用，并对正常组织不产生明显不良反应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物ICR 6周龄♀小鼠，体质量18～20 g，浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2细胞HeLa细胞，本实验室保存，购自上海中科院细胞所。

1.1.3质粒pEGFP-C1质粒DNA(上海交大农业与生物学院李博士惠赠)。

1.1.4主要试剂质粒 DNA小提试剂盒(Omega)、无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技有限公司)、AxyPrep DNA回收试剂盒(爱思进生物技术有限公司)、内切酶 AgeⅠ和 AseⅠ(NEB)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen)。

1.1.5主要仪器倒置荧光显微镜(OLYMPMS CORPPRAT10N TH4-200)、PCR 仪(Bio-RAD sigh no.580BR1557)、核酸测定仪 (Amersham Biosciences Ultrospec 3300 pro)、流式细胞仪(Epics Altra AK25012)、紫外检测器 (上海嘉鹏科技有限公司ZF型)。

1.2 方法

1.2.1构建caeVEGF-EGFP真核表达质粒用颈椎脱臼法猝死小鼠，取出肝脏组织，提取小鼠肝脏基因组DNA。以此为模板，设计正、反向引物分别为:5'-ATTAATTTTAGAAGATGAACCGTAAGCCTAGGC-3'和 5'-ACCGGTGAT ACCTCTTTCGTCTGCTGA-3'，PCR扩增获得小鼠VEGF调控序列(caeVEGF)。PCR产物连接至PMD-18T载体，构建成caeVEGF-18T质粒。连接产物转化大肠杆菌DH5α后，挑取单克隆菌落筛选，阳性克隆测序鉴定，测序正确后采用AseI、AgeI进行双酶切;酶切产物连接到EGFPC1构建成caeVEGF-EGFP真核表达质粒，并PCR鉴定。

1.2.2稳定转染细胞株建立HeLa细胞在含10%新生小牛血清于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。待细胞生长至80% ～90%时，按照 LipofectamineTM2000(Invitrogen)脂质体转染试剂盒说明书操作进行转染。即将脂质体与质粒按一定比例混合后转染入HeLa细胞，48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，在含有G418(600 mg·L－1)的选择性培养基中加压筛选5周，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，扩增培养即得到稳定表达小鼠caeVEGF-EGFP的HeLa细胞系。

1.2.3抗血管生成药物筛选平台验证

1.2.3.1阳性药物姜黄素(Curcumin，Cur)处理浓度确定 取上述指数生长期的稳定转染细胞传板24 h后，用系列浓度的Cur处理48 h，MTT法测定细胞生长抑制率，确定Cur处理浓度;即经Cur处理后大部分细胞生长均不受抑制的浓度。

1.2.3.2荧光显微镜及流式细胞仪分析 细胞接种6孔板，并用不同浓度的 Cur及 100 μg·L－1的LPS单独或一起处理24 h，每个处理组做3个重复;倒置荧光显微镜拍照记录，然后胰酶消化上流式细胞仪分析各处理组荧光强度;比较分析，确证所建细胞株作为抗血管生成药物筛选平台的可行性。

2 结果

2.1caeVEGF-EGFP稳定转染细胞系建立通过筛选获得稳定转染细胞系，结果如Fig 1所示。比较Fig 1 A～C，可以发现，转染pEGFP-C1质粒的细胞荧光强度非常强，而转染caeVEGF-EGFP质粒的细胞荧光强度明显偏弱，表明，在正常情况下caeVEGF并不是一个非常强的启动子。

Fig 1 Stable transfection cell lines

2.2抗血管生成药物筛选平台可行性验证

2.2.1阳性药物Cur处理浓度确定转染 cae-VEGF-EGFP质粒的HeLa细胞(HVEGFP)传96孔板，用系列浓度的Cur处理48 h，MTT法测定细胞生长抑制率，结果如Fig 2所示。从图中可以明显看出，10 μmol·L－1至 25 μmol·L－1之间 Cur对 HeLa细胞的抑制率呈线性增强，相对而言，8 μmol·L－1以下浓度对HeLa细胞的生长抑制不十分明显，为此，初步确定8 μmol·L－1以下浓度为处理浓度。

Fig 2 The concentration-inhibition ratio curve of Cur against HVEGFP

2.2.2HVEGFP对药物诱导验证HVEGFP 接种6孔板，并用不同浓度的Cur及100 μg·L－1的LPS单独或一起处理24 h，倒置荧光显微镜拍照记录(固定放大倍数及曝光时间)，然后胰酶消化上流式细胞仪分析各处理组荧光强度，结果如Fig 3、4所示。比较 Fig 3 A～C及 Fig 4，可以明显看出，HVEGFP细胞经100 μg·L－1LPS处理后荧光明显增强(约4.3 倍)，而经 6 μmol·L－1Cur处理后荧光强度又明显减弱，抑制率达56.5%;此外，Cur可以剂量依赖性抑制LPS诱导的GFP表达。

上述结果表明，LPS可以作用于HVEGFP细胞，通过VEGF调控序列诱导GFP过量表达，而阳性药物Cur则可以通过干扰或抑制LPS这一过程，从而降低GFP表达;即反应了Cur具有抗血管生成作用，应证了本实验所建立的抗血管生成药物筛选平台是可行的。

3 讨论

本文以LPS为刺激因素模拟肿瘤体内微环境，以VEGF调控序列为作用对象，以EGFP为报告基因，构建表达载体，建立稳定转染细胞系，并以姜黄素为阳性药物，验证建立抗血管生成药物筛选平台的可行性;从上述初步实验结果看，证明本思路是完全可行的。

所建立的筛药平台能否对LPS有应答，是评判其成功与否的首要因素，葛海燕等［5］研究表明，LPS 100 μg·L－1处理24 h即可明显上调 VEGF表达，为此，本文预实验即采用该浓度进行了处理;结果表明，该浓度LPS处理后荧光强度相比未处理组提高了4.3倍，与相关报道一致，因此，没有对LPS浓度做进一步优化。姜黄素体外具有较强的抗肿瘤活性，其体内外抗血管生成作用及其作用机制已有大量文献报道，本实验结果表明，姜黄素10 μmol·L－1至 25 μmol·L－1之间处理 48 h，对 HeLa 细胞呈现线性抑制作用;为此，我们采用6 μmol·L－1以下浓度，处理24 h对细胞荧光强度变化进行了观察。结果表明，在基本不影响细胞生长状态下，姜黄素对LPS诱导的荧光增强具有抑制作用，并呈剂量依赖性;上述结果证实了抗血管生成筛药平台的可行性。

此外，研究表明［6］，除了肿瘤病理组织存在大量血管异常增生之外，还有其它一些疾病存在类似现象，如类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、年龄相关的黄斑退行性改变及动脉粥样硬化［7］等。在这些疾病中VEGF也起着类似作用，为此，本文所建立的筛药平台所获得的抗血管生成药物同样适用于这类疾病。

Fig 3 Fluorescence picture of HVEGFP after co-or dependent treatment with Cur and LPS(20×)

Fig 4 Fluorescence intensity analysis by flow cytometry

从理论上而言，本文采用VEGF整个调控序列构建筛药模型，具有“多靶点单效应”特点，有利于中药复方和有效部位及药物间相互协同作用方面的研究，相比单个因子结合序列构建的筛药模型(单靶点单效应)也不易造成漏筛结果。

［1］韩文峰，魏素菊.VEGF-A在肿瘤中的研究进展［J］.河北医药，2010，32(2):214 －6.

［2］Han W F，Wei S J.VEGF-A in cancer research［J］.Hebei Med J，2010，32(2):214 －6.

［2］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.NEngl J Med，1971，285:1182 －6.

［3］丰俊东，徐晓玉，胡益勇，等.川芎嗪对VEGF受体与其放射性配体结合的抑制［J］.中国药理学通报，2005，21(8):939－42.

［3］Feng J D，Xu X Y，Hu Y Y，et al.Tetramethylpyrazine inhibition on binding of radiolabeled ligand to VEGFR［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(8):939 －42.

［4］Shima D T，Kuroki M，Deutsch U，et al.The mouse gene for vascular endothelial growth factor.Genomic structure，definition of the transcriptional unit，and characterization of transcriptional and post-transcriptional regulatory sequences［J］.J Biol Chem，1996，271(7):3877－83.

［5］葛海燕，冯 健，贲素琴，等.蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达［J］.南通大学学报，2008，28(4):248－50.

［5］Ge H Y，Feng J，Ben S Q，et al.Protein kinase C mediates lipopolysacch-ride-induced VEGF gene expression in rat pulmonary microvascular endothelial cells［J］.Nantong Daxue Xuebao，2008，28(4):248－50.

［6］陈 刚，徐晓玉，叶 兰，等.川芎嗪对大鼠胶原性关节炎滑膜VEGF及 VEGFmRNA表达的影响［J］.中国药理学通报，2006，22(10):1199 －202.

［6］Chen G，Xu X Y，Ye L，et al.Effects of tetramethylpyrazine on the expression of vascular Endothelial growth factor in synovium of collagen-induced arthritis in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(10):1199－202.

［7］Dulak J，Jozkowicz A，Frick M，et al.Vascular endothelial growth factor:angiogenesis，atherogenesis or both［J］?J Am Coll Cardiol，2001，38(7):2137－8.