凹顶藻萜提取物对荷H22肿瘤小鼠氧化应激及p53和 MMP-9表达的影响

梁 惠，刘 颖，韩 磊，贺 娟，张文卿，马爱国

(1.青岛大学医学院营养研究所，山东 青岛 266021;2.青岛大学医学院细胞与分子生物学实验室，山东青岛 266071;3.青岛大学医学院附属医院营养科，山东青岛 266003;4.青岛大学医学院病原生物学实验室，山东 青岛 266071)

肝癌是严重危害人类生命健康的顽症之一。近年来，海洋萜类化合物的天然抗氧化、抗肿瘤活性已引起人们的广泛关注［1］。凹顶藻是海洋萜类化合物的重要来源，课题组前期已从三列凹顶藻中成功获得总萜含量为63.3%的凹顶藻萜提取物，并进行一系列体内外实验，获得了可喜的研究结果［2－4］。但目前关于凹顶藻萜类化合物对 H22肿瘤p53和MMP-9表达及氧化应激水平的影响，国内外尚未见相关报道。本实验以凹顶藻萜提取物为干预物，观察其对小鼠H22肿瘤的抑制作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及瘤株清洁级昆明小鼠，18～23 g，♂，由青岛市实验动物中心提供。H22小鼠肝癌细胞株，由中国医学科学院药物研究所引进。

1.2主要试剂凹顶藻萜提取物(LTE)，为本实验室所有;兔抗小鼠突变型p53抗体、MMP-9抗体(北京中山生物技术有限公司);免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司);SOD及MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);

1.3动物模型的建立40只昆明小鼠随机分为模型组、LTE低、中、高剂量干预组。于小鼠左前肢腋窝皮下接种2×109·L－1的H22肝癌细胞悬液0.2 ml。24 h后，模型组给予大豆色拉油0.5 ml·d－1灌胃;LTE低、中、高剂量干预组给予大豆色拉油稀释的 LTE 溶液 25、50、100 mg·kg－1·d－10.5 ml灌胃;各组均连续给药2周，观察小鼠生长情况。

1.4样品采集末次给药24 h后，小鼠腹主动脉取血，肝素抗凝，用于抗氧化指标检测。完整剥离肿瘤，计算抑瘤率。抑瘤率/%=(对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

1.5LTE对小鼠H22肿瘤组织中突变型p53和MMP-9表达的影响取上述各组小鼠新鲜肿瘤组织常规做石蜡切片，按照SP免疫组化试剂盒说明书操作。

1.6LTE对H22小鼠血浆过氧化指标的影响按照试剂盒说明书操作。

1.7LTE对红细胞溶血度的影响采用比色法检测。

1.8统计学处理使用SPSS11.5软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1实验小鼠成瘤情况模型组小鼠肿瘤生长潜伏期(TT)短，2 d即可成瘤，且生长迅速。与模型组比较，LTE各剂量组小鼠TT达到3～4 d，肿瘤生长缓慢。各组小鼠成瘤率为100%。

2.2LTE对H22小鼠肿瘤质量的影响模型组小鼠肿瘤质量较大，达到(2.68±0.86)g;LTE各组小鼠H22肿瘤生长均明显受到抑制，分别达到(1.94±0.52)、(1.74±0.65)和(1.56±0.44)g，与模型组比较，差异有显著性(P＜0.05)。且随着药物剂量的增加，抑瘤率逐渐升高，分别达到27.5%、34.9%和41.4%，具有量效依赖趋势。

2.3LTE对小鼠H22肿瘤组织中突变型p53和MMP-9表达的影响LTE高剂量组突变型p53和MMP-9阳性细胞表达率下降，与模型组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。见Tab 1。

Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

*P＜0.05 vs model group

Group n Dose/mg·kg－1·d －1 Positive rate/%p53 MMP-9 Model 9 0.00 42.5 ±1.31 75.1 ±2.68 LTE 9 25.00 35.6 ±1.69 65.9 ±1.52 8 50.00 30.1 ±1.74 42.6 ±1.36*7 100.00 20.8 ±0.64* 32.5 ±0.83*

2.4LTE对H22小鼠血浆过氧化指标的影响LTE高剂量组SOD酶活力明显升高，而中、高剂量组MDA含量则减少，与模型组比较，差异有显著性(P＜0.05)。见Tab 2。

2.5LTE对H22小鼠红细胞溶血度的影响中、高剂量组红细胞溶血度明显下降，与模型组比较，差异有显著性(P＜0.05)。见Tab 2。

Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

*P＜0.05 vs model group

Group n Dose/mg·kg－1·d－1 hemolytic degree/%Model 9 0.00 28.87 ±3.17 57.98 ±4.16 14.52 ±5.67 SOD/kU·L－1 MDA/μmol·L －1 LTE 9 25.00 35.01 ±5.84 45.22 ±8.81 11.42 ±6.63 8 50.00 42.95 ±7.23 32.39 ±6.16* 7.57 ±3.34*7 100.00 57.13 ±6.38* 24.85 ±3.68* 6.40 ±2.16*

3 讨论

突变型p53蛋白是肿瘤组织所特有的标志蛋白，检测该基因蛋白在肿瘤组织中的表达情况是反映肿瘤生长状况的一个重要指标［5］。MMP-9又称明胶酶B(gelatinase-B)，检测肿瘤组织中MMP-9蛋白的表达情况对评价药物对肿瘤的治疗效果具有重要意义［6］。本实验结果显示，LTE干预组肿瘤生长普遍被抑制，同时，其p53和MMP-9蛋白的表达水平明显下降。表明LTE可通过下调p53和MMP-9等凋亡相关蛋白的表达，限制肿瘤组织的侵袭和转移能力，抑制小鼠H22肿瘤组织生长。

大量研究证实，肿瘤患者可通过多种途径引发氧化应激，而提高SOD、GSH等抗氧化剂的表达水平及活性，可明显抑制肿瘤细胞的生长并诱导其发生凋亡。H2O2是活性氧的一种，通常被用于诱导红细胞溶血，以检测红细胞膜抗氧化能力［7］。本实验结果显示，一定剂量的LTE可明显提高H22荷瘤小鼠血浆中SOD酶活力，降低脂质过氧化物MDA含量，减少H2O2诱导的红细胞溶血。表明LTE具有较强的抗氧化活性，可有效阻止脂质过氧化反应，提高机体抗氧化能力，这可能也是LTE抑制H22肿瘤生长的另一机制。

总之，凹顶藻萜类化合物作为一种海洋天然活性物质，可有效抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长，值得进一步开发利用和深入探索。

［1］Cheung F W，Li C，Che CT，et al.Geoditin A induces oxidative stress and apoptosis on human colon HT29 cells［J］.Mar Drugs，2010，8(1):80 －90.

［2］董春景，梁 惠，贺 娟，马爱国.海藻萜类化合物对二甲基苯蒽诱导的大鼠乳腺癌的抑制作用［J］.营养学报，2007，29(2):197－8.

［2］Dong C J，Liang H，He J，Ma A G.The Antitumor effects of laurencia terpenoids extract on breast carcinoma induced by DMBA in rats［J］.Acta Nutr Sin，2007，29(2):197 －8.

［3］刘 颖，梁 惠，苏 爱，等.海兔素对人胃癌细胞 SGC-7901增殖和凋亡的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(3):333－7.

［3］Liu Y，Liang H，Su A，et al.Effect of aplysin on the proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell SGC-7901［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):333 －7.

［4］刘 颖，梁 惠，徐宏伟，等.海兔素对S180荷瘤小鼠的抑瘤活性及其免疫作用的实验观察［J］.中国药理学通报，2006，22(11):1403－5.

［4］Liu Y，Liang H，Xu H W，et al.Anticancer activities and imm unologic function of Aplysin［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1403－5.

［5］Acun T，Terzioglu-Kara E，Konu O，et al.Mdm2 Snp309 G allele displays high frequency and inverse correlation with somatic p53 mutations in hepatocellular carcinoma［J］.Mutat Res，2010，684(1－2):106－8.

［6］Ahmad A，Kong D，Wang Z，et al.Down-regulation of uPA and uPAR by 3，3'-diindolylmethane contributes to the inhibition of cell growth and migration of breast cancer cells［J］.J Cell Biochem，2009，108(4):916 －25.

［7］Acharya A，Das I，Chandhok D，Saha T.Redox regulation in cancer:a double-edged sword with therapeutic potential［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3(1):23－34.