葛根素注射液对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

何正光，陈 刚，祝慧凤，叶 兰，徐晓玉

(1.重庆师范大学医院，重庆 400047;2.重庆工商大学药物研究中心，重庆 400067;3.西南大学药学院/重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆 400716;4.贵阳医学院药学院，贵州贵阳 550004)

脑梗死是中老年高发病，脑梗死后缺血区微血管受损，缺失［1］。葛根素注射液临床上广泛用于脑缺血，疗效明显。对血管内皮细胞有促增殖，抑钙超载，抗氧化等作用［2］，对脑缺血有明显的保护作用。本实验用大鼠脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，CIR)模型，从促血管新生角度探讨葛根素治疗脑缺血的机制，观察其时效、量效关系。

1 材料与方法

1.1动物♂ SD大鼠，体重质量(250±30)g，重庆医科大学动物中心提供。合格证:SCXK(渝)20020003。

1.2药品与试剂葛根素注射液，规格:2 ml:葛根素100 mg，批号20040601，江西银涛药业有限公司。Ⅷ因子抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司;VEGF抗体、Angiopoietin-1抗体、Angiopoietin-2抗体、VEGF原位杂交试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

1.3模型制备、不纳入标准及分组按李琴［3］等的方法，线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉局灶脑缺血模型，缺血2 h后再灌注。不纳入标准:评分低于2分;蛛网膜下腔出血;HE染色无缺血病理改变;未到时相点死亡。每组各6只，随机分为 12 组:0 h CIR:108、54、27 mg·kg－1;24 h CIR:108、54、27 mg·kg－1;48 h CIR:108、54、27 mg·kg－1。

1.4给药及取材给予葛根素腹腔注射，每天1次，连续7 d。模型组给同容积的50%丙二醇。动物达到时相点后，用恒流泵经心脏灌注含0.1%DEPC多聚甲醛固定。立刻取脑，作前脑视神经交叉处2 mm厚冠状切片。

1.5检测

1.5.1神经行为学评分动物处死前，参照Zea Longa 5分制标准对神经功能评分。

1.5.2免疫组化检测VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白及MVD，原位杂交检测VEGF mRNA 用Image proplus 5.0进行光密度(IOD)分析。IOD值均按测得值×10－6计算。MVD的判断:部位选在海马近梗死区半暗带。

1.6统计学分析软件SPSS13.0完成数据分析，以±s表示，组间用方差分析和t检验。

2 结果

2.1葛根素对CIR大鼠行为学改变的影响葛根素组可改善CIR大鼠的神经行为障碍，与模型组比，评分减少，差异有显著性。见Tab1。

Tab 1 Effect of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats with neurological severity score(±s，n=6)

Tab 1 Effect of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats with neurological severity score(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CIR group

Group Dose/mg·kg－1 Neurological severity score 0 h 24 h 48 h Sham 1.83 ±0.26 1.75 ±0.27 1.75 ±0.27 Puerarin 27 1.42 ±0.38* 1.42 ±0.20* 1.33 ±0.26*54 1.25 ±0.27＊＊ 1.33 ±0.26* 1.33 ±0.26*108 1.08 ±0.20＊＊ 1.17 ±0.26＊＊1.25 ±0.27*

2.2葛根素组大鼠VEGF、Ang-1、Ang-2、MVD表达的影响药物组与模型组比，MVD明显增加(P＜0.01)。VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白表达明显增加(P＜0.05)。VEGFmRNA原位杂交与VEGF蛋白表达一致。见Tab 2。

3 讨论

过度表达［4］或外源性VEGF［5］能使MVD增高。VEGF加重occludin和zonula occluden-1两种连接蛋白降解致血脑屏障破坏［6］。Ang-1在保持血脑屏障的稳定和血管生成中起重要作用［7－8］，联用VEGF和Ang-1使血管内皮细胞间连接更紧密［9］。联用VEGF和Ang-2比单用VEGF更有助血管内皮细胞的增殖和迁移［10］。

Tab 2 VEGF，VEGFmRNA，Ang-1，Ang-2 expression of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and the difference of microvessel density(±s，n=6)

Tab 2 VEGF，VEGFmRNA，Ang-1，Ang-2 expression of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and the difference of microvessel density(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CIR group of same time point

Group(n=6)18 32.67 ±2.88 Puerarin 27 0 3.85 ±0.13＊＊ 3.90 ±0.14＊＊ 3.73 ±0.16＊＊ 4.02 ±0.14* 40.33 ±2.58＊＊54 0 4.12 ±0.23＊＊ 4.16 ±0.19＊＊ 3.90 ±0.08＊＊ 4.06 ±0.21* 49.67 ±2.94＊＊108 0 4.45 ±0.16＊＊ 4.75 ±0.17＊＊ 4.08 ±0.18＊＊ 4.24 ±0.14＊＊ 53.50 ±2.88＊＊Sham 24 3.04 ±0.14 3.08 ±0.13 3.01 ±0.12 3.79 ±0.11 32.83 ±2.71 Puerarin 27 24 3.54 ±0.13＊＊ 3.90 ±0.18＊＊ 3.52 ±0.08＊＊ 4.00 ±0.14* 40.67 ±2.16＊＊54 24 3.86 ±0.12＊＊ 4.09 ±0.14＊＊ 3.75 ±0.11＊＊ 4.01 ±0.16* 50.33 ±2.58＊＊108 24 4.15 ±0.16＊＊ 4.69 ±0.16＊＊ 3.87 ±0.12＊＊ 4.13 ±0.21＊＊ 52.33 ±2.94＊＊Sham 48 3.07 ±0.17 3.09 ±0.13 3.04 ±0.13 3.80 ±0.13 33.17 ±3.77 Puerarin 27 48 3.48 ±0.19＊＊ 3.85 ±0.14＊＊ 3.50 ±0.16＊＊ 3.99 ±0.10* 40.67 ±2.73＊＊54 48 3.77 ±0.18＊＊ 3.93 ±0.22＊＊ 3.72 ±0.15＊＊ 4.01 ±0.13* 49.33 ±2.73＊＊108 48 4.10 ±0.12＊＊ 4.64 ±0.16＊＊ 3.84 ±0.15＊＊ 4.12 ±0.17＊＊ 52.33 ±3.72 MVD Sham 0 3.02 ±0.07 3.07 ±0.10 2.99 ±0.10 3.79 ±0.Dose/mg·kg－1 Time/h VEGF(IOD)VEGF mRNA(IOD)Ang-1(IOD)Ang-2(IOD)＊＊

本研究用大鼠CIR模型，发现葛根素可明显改善神经行为，增加了MVD及VEGF、Ang-1、Ang-2的表达。大剂量0 h给药组最为明显。我们推测葛根素能减轻CIR损伤，机制与促血管生成有关;量效关系有一定的剂量依赖;时效关系显示，给药越早，效果越好。

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