COPD患者诱导痰中TNF-α、IL-6表达水平的临床研究

蒋 萍 黄树红 陈淑敏 王桂英

（山东省阳信县人民医院，山东 阳信 251800）

慢性阻塞性肺疾病 （COPD）是一种以气流受限为特征的疾病，研究证实气道炎症尤其是小气道炎症是COPD的主要病变和发病的主要原因，肿瘤坏死因子α （TNF-α）在气道局部炎症中起重要作用。但到目前为止，诱发和控制慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）炎症的机制尚未清楚，可能与气道内炎性因子与抗炎介质的失衡，或内源性抗炎机制缺陷有关。气道局部炎症机制的研究方法有多种，诱导痰技术由于安全可靠等原因，更适合进行气道局部炎症机制的研究。为此，我们通过测定COPD急性加重期患者诱导痰液中TNF-α和IL-6的水平，以探讨其在COPD急性加重过程中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2009年3月至2010年12月我院呼吸科住院的COPD急性加重期患者共38例，男25例，女13例；年龄50～85岁；病程5～40年。COPD缓解期患者38例，男28例，女10例；年龄55～86岁；病程8～35年。所有病例均符合2007年中华医学会呼吸病学分会制订的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》的标准[1]，并在入选前4周内未吸入糖皮质激素，3个月内未全身使用糖皮质激素治疗，X线证实无肺炎者，近4周内没有用过抗生素和呼吸系统之外的细菌感染者。健康对照组28例，入选标准：非吸烟者，无呼吸道症状及心肺等疾患，入选前4周内无呼吸道感染史。排除标准：除外合并支气管哮喘、支气管扩张症等其他慢性呼吸系统疾病，除外合并其他全身炎症性疾病、过敏性疾病、肿瘤性疾病、系统性免疫功能异常等可能引起补体活化的疾病。全部研究对象均获得知情同意。

1.2 方法

①样本采集：开水或生理盐水彻底漱口、擤鼻涕、清理口腔和鼻腔分泌物，吸入沙丁胺醇200μg，20min后雾化吸人3%无菌高渗氯化钠溶液20～30min，留痰于无菌干燥盛痰杯中，如受试者在雾化吸人过程中出现喘息、恶心呕吐、呼吸困难及其他难以忍受的症状则随时终止试验，并给予沙丁胺醇200μg吸入，观察至症状缓解。②诱导痰的采集、处理和质量控制：参照文献[2]的方法进行。整个过程尽量在2h内完。取无唾液成份的痰液放人离心试管中，加4倍体积的1 g/L二硫苏糖醇孵育，螺旋振荡15min，加入与二硫苏糖醇等体积的Hank's液，再置于37℃恒温水浴振荡箱振荡15min使其均匀，3500r/min（r=15cm），离心20 min，沉淀细胞作痰液质量检查，上清液于-80℃冻存待测。沉淀细胞用Hank'液悬浮，在血细胞仪上计数细胞总数，用台盼蓝染色排除法测定细胞存活率。调节细胞悬浮密度至1×106，将75μL悬浮液置于细胞离心机450 r/min离心6 min，细胞沉渣涂片，风干，吉姆萨染色，每张涂片计数400个细胞。分类计数，鳞状上皮细胞＜20%，细胞存活率＞50%提示痰来源于下呼吸道，为合格标本，可进行有关生化测定。③测定TNF-α和IL-6：采用ELISA法测定痰上清中TNF-α和IL-6 （美国BD公司生产上海西唐生物科技有限公司提供试剂盒）严格按照试剂说明书操作。④肺功能检测：所有观察对象均使用肺功能仪测定FEV1，FVC，并计算出第一秒用力呼气流量占预计值百分数（FEV1%pre）和FEV/FVC%等。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组间肺功能指标比较

急性加重组、稳定期组FEV1%p re较健康对照组明显降低（P＜0.01）；急性加重组、稳定期组FEV1/FVC%、MMEF%pre较健康对照组明显降低（P＜0.01）；急性加重组、稳定期组PEF%pre较健康对照组明显降低（P＜0.01）；急性加重组、稳定期组RV%pre较健康对照组明显升高（P＜0.01）。见表1。

2.2 各组间诱导痰上清液中IL-6、TNF-α浓度比较

表1 各组间肺功能指标比较

急性加重组、稳定期组患者诱导痰上清液中TNF-α、IL-6浓度较健康对照组明显升高（P＜0.05）；急性加重组患者诱导痰上清液中

TNF-α、IL-6浓度较稳定期组明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组间诱导痰上清液中TNF-α、IL-6浓度比较

2.3 诱导痰上清液中IL-6浓度与肺功能气流阻塞指标FEFV1%pre、

FEV1/FVC%呈负相关（r=-0.689，P＜0.01；r=-0.673，P＜0.01）；

3 讨 论

COPD是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD是由多种炎性细胞及其所释放的多种炎性递质、细胞因子参与的复杂的慢性气道炎症。COPD急性发作时，病毒或细菌所含的某些抗原成分或代谢产物如脂多糖、内毒素可以激活局部肺泡巨噬细胞产生 TNF-α等炎性因子[3]。这些炎性因子继而又可促进肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞产生 IL-6、IL-8。由于局部产生的细胞因子吸收入血以及内毒素引起体内单核-巨噬细胞广泛的激活，导致血中 TNF-α升高。学者多次研究发现 COPD 急性发作期患者血中IL-6、IL-8水平与TNF-α水平呈明显正相关。急性感染时，通过巨噬细胞激活使TNF-α的产生增多，而TNF-α可促进炎症细胞粘附游走和浸润，迅速引起肺组织损伤。表明TNF-α是COPD病情加重的一个重要指标，也是COPD严重程度的重要标志。

IL-6是一种主要由活化的单核细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞、内皮细胞及成纤维细胞等分泌的具有多种生物学功能的细胞因子，因分子结构中保留了2个半胱氨酸残基而表现出化学趋化作用，参与COPD的气道炎症和气道重塑[4]。

TNF-α是具有广泛生物活性的炎性因子，参与了炎症过程中中性粒细胞的聚集和活化，使 COPD患者气道黏膜中大量的中性粒细胞浸润。研究发现COPD患者诱导痰和血浆中 TNF-α水平均较非 COPD患者明显增高。目前为止，COPD炎症机制尚未明确，可能与炎性因子和抗炎递质的失衡有关[5]。随着局部炎症的好转，患者症状改善，病情趋于缓解。

本实验结果显示：COPD急性发作期TNF-α、IL-6表达水平与FEV1%pre值呈直线负相关，提示这些指标在炎性反应的发展过程中均发挥了作用。

[1] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(1):8-17.

[2] 曾勉,刘凌云,张式鸿,等.各期慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰细胞成分与肺功能的关系[J].中山大学学报:医学科学版,2007,28(4):422-425.

[3] Hacker T,Holloway,Holqate ST,et al.Dynamics of pro-inf l ammatory and anti-inf l ammatory cytoline release during acute inf l ammation in cllrom c obstructive pulmonary disease: an ex vivo study[J].Respir Res,2008,9(1):472.

[4] DE BOER W I. Cytokines and therapy in COPD[J]. Chest,2002,121(2):209S-218S.

[5] 王卓,夏国光,姚婉贞.慢性阻塞性肺疾病急性加重期病原学研究[J].中国全科医学,2009,12(11):1942.