巢式PCR检测血清中烟曲霉基因的实验研究

李芳秋,周万青,王立魁,史利宁,邵海枫

(南京军区南京总医院·解放军临床检验医学研究所,江苏南京210002)

曲霉菌属已成为免疫功能低下患者致命性感染的重要致病因子。其易感人群包括中性粒细胞减少症、同种异体造血干细胞移植或肺移植、HIV感染晚期以及遗传性免疫缺陷症患者。侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的确诊或临床诊断需要病原学依据,由于血培养阳性率极低,曲霉特异性诊断标志缺乏,使得病原学诊断困难,阻碍着及时、有效的治疗[1]。扩增曲霉特异性基因(通常为编码核糖体RNA的基因)的PCR诊断方法,已经在侵袭性曲霉病的诊断中显示出良好的应用前景[2、3]。本实验将利用烟曲霉播散性感染动物模型,取不同感染时段外周血分别进行PCR测定和曲霉培养,考查巢式PCR对侵袭性曲霉感染的早期诊断的可行性。还检测了25例临床患者外周血中烟曲霉基因,并与GM试验结果比较,评价巢式PCR方法在IA诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1主要试剂及仪器Taq DNA聚合酶及dNTPs(Promega公司),蛋白酶K(Merck公司),E.Z.N.A.Fung DNA Kit(Omega公司),100bp DNA Marker(Fermentas公司);PlateliaTM Aspergillus EIA GM Kit(Bio-Rad公司);PCR扩增仪及紫外分光光度计(Eppendorf公司),凝胶成像分析系统(捷达公司)。

1.2实验动物及主要药物新西兰白兔由南京军区南京总医院实验动物中心提供,体重2.5-3.5 Kg,雌性,1只/笼,常规饲养。注射用氢化可的松,天津金耀氨基酸有限公司,批号:0710312;注射用头孢他啶,广州白云山天心制药股份有限公司,批号:080801。

1.3菌株及分生孢子的制备烟曲霉(A1株,由中科院皮肤病研究所馈赠)接种SDA斜面培养基,28℃培养4天,用含0.5%Tween-20的生理盐水冲洗菌落获得分生孢子,并在旋涡振荡器上剧烈振荡使成单个孢子,离心收集上清中单个孢子悬液。用细胞计数板计数孢子浓度并调整为(1-5)×109/ml。

1.4实验动物分组及处理[4](1)动物分组:对照组,正常兔1只,未免疫抑制,未接种烟曲霉。实验组,侵袭性烟曲霉感染兔3只,接受免疫抑制,接种烟曲霉。(2)免疫抑制处理:接种前两天,每只兔子肌肉注射氢化可的松10 mg/Kg/天,接种当天和接种后三天给予同等剂量的氢化可的松。实验期间,每只兔子肌肉注射头孢他定70 mg/Kg/天,预防细菌感染。(3)烟曲霉分生孢子接种:经耳缘静脉注射1×106/ml烟曲霉分生孢子悬液1 ml。(4)动物标本的采集:动物感染后隔天采集一次血液,分别进行培养及血清保存;患病动物濒死前解剖,取各脏器匀浆后培养,并分别取不同脏器进行组织病理学检查。(5)影像学检查:在感染后不同时期分别对感染动物进行X光摄片及CT检查。

1.5临床标本按照IA诊断标准[5],将25例住院病人纳入研究对象,其中男性19例,女性6例,年龄21-84岁。其中,确诊1例,临床诊断12例,拟诊12例,共计45份血清样本。另收集健康体检者血清20份。分别进行巢式PCR检测和血清半乳甘露聚糖水平的测定。

1.6巢式PCR参照文献[6]选取曲霉特异巢式PCR引物。外侧引物:M5c 5′-AGGGCACCACAAGGCGTGGA-3′,M6b 5′-AAGAAGCCAGCGGCCCGCAA-3′,扩增产物 209 bp;内侧引物:M5cN 5′-GACTCAACACGGGGAAACTC-3′,M6bN 5′-TAAGGGCCGAGGTCTCGTTC-3’,扩增产物136 bp。引物由上海英骏公司合成。PCR反应体系为20 μ l:模板 DNA 5 μ l,10× buffer(无 Mg2+)2 μ l,1 U Taq 酶,10 mM 各种dNTP,37.5 mM MgCl2,上下游引物各2.5 pmol。血液标本经离心后收集血清,-20℃保存,标本处理步骤[7]如下 :100 μ l 血清中加入 100 μ l血清处理液(100 mM KCl,20 mM Tris·HCl,pH 8.3,5 mM MgCl2,0.2 mg/ml明胶,0.9%Tween-20),混匀,加入蛋白酶K至浓度为 60 μ g/ml,混合物置55℃水浴60 min,然后95℃10 min以灭活蛋白酶K,12 000×g,4℃离心10 min。取上清液 5 μ l进行单次扩增反应:94℃45 s,57℃1min,72℃90 s,40个循环 ;取1 μ l扩增产物作为模板进行巢式扩增反应:94℃15 s,60℃30 s,72℃60 s,30个循环。取5 μ l反应产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察,拍照。

1.7临床标本GM测定GM测定参照说明书进行,大致如下:分别将阳性、阴性、cut-off质控品(试剂盒提供)、待检患者血清300 ml与100 ml血清标本处理液(试剂盒提供)振荡混匀,100℃水浴3 min,12 000×g离心10 min,分别将50 ml辣根过氧化物酶标记的EB-A2和50 ml处理后上清加入已包被有EB-A2的微孔板内,封板,37℃孵育90 min,然后用洗液洗涤5次,加入底物避光作用30 min后加入100 ml反应终止液,在Microplate Reader 550型酶标仪(Bio-Rad)450/620 nm处读取吸光度值(A值)。以cut-off质控物A值介于0.3-0.8、阳性对照A值/cut-off质控物A值均值＞2、阴性对照A值/cut-off质控物A值均值＜0.4作为实验在控的标准。患者血清GM值计算公式:患者血清A值/cut-off质控物A值均值,此值＞0.5判为阳性,否则为阴性。

1.8统计学处理两样本均数比较采用t检验,两样本率比较采用 χ2检验,采用SPSS 11.0软件进行统计,P＜0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1感染动物真菌培养结果感染后隔天采集血液标本接种SDA培养基,所有血样培养结果均未生长烟曲霉;解剖采取肝、肺、肾、脾等脏器匀浆后接种SDA培养基,三天后均生长烟曲霉。

2.2感染动物影像和病理检查结果在病程中多次对实验动物进行影像学检查。感染第11天X光摄片检查并未发现明显感染病灶;感染第17天肺部CT检查发现真菌感染影像改变:肺纹理增多、紊乱,肺透亮度减低,见多发散在斑片状致密影,呈毛玻璃样改变。尸检解剖取不同脏器进行HE、PAS和银染。结果见所采集各脏器呈不同程度的炎症反应、大量脓肿形成及坏死病灶,并可见真菌孢子及烟曲霉特征性呈45°分叉菌丝。

2.3巢式PCR结果

2.3.1曲霉引物通用性及特异性 以本院微生物室保存的4种曲霉(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉及棒曲霉),白假丝酵母菌等5种假丝酵母菌,新型隐球菌及大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、肺炎克雷柏杆菌为对象,真菌以E.Z.N.A.Fung DNA Kit提取各基因组DNA,细菌常规煮沸裂解法提取DNA。分别应用该巢式PCR进行检测。结果显示,该反应体系在4种曲霉中均可扩增出相应条带(209 bp/136 bp),而其余常见真菌及细菌均为阴性。

2.3.2单次PCR和巢式PCR检测限 分别向100 μ l健康体检者血清中加入不同稀释度的烟曲霉DNA,以未加烟曲霉DNA血清为阴性对照,然后经过标本处理后用于PCR检测。单次和巢式PCR最低检测限分别为 6×10-10g/100 μ l和6×10-13g/100 μ l(见图 1)。

2.3.3动物血清样本检测结果 兔血清经过处理后行巢式PCR检测,结果显示,实验组家兔均可检测到阳性,而对照组家兔所有血清均未检测到目的基因。实验组家兔中最早可在感染的2天即可检测阳性,并可持续数日(见表1)。

图1 巢式PCR检测模拟血清标本检测限

表1 巢式PCR检测动物模型血清标本结果

2.3.4临床患者样本检测结果 25例患者共45份标本用巢式PCR检测烟曲霉DNA以及GM测定结果见表2。1例确诊IA,DNA测定和GM测定都获得阳性结果。临床诊断IA患者12例,22份血清,巢式PCR结果敏感性为67.7%,而GM的敏感性为58.3%,二者差异不具统计学意义(P＞0.05);样本阳性率分别为59.1%和54.5%,亦不具差异性(P＞0.05)。拟诊IA患者,巢式PCR和GM的敏感性分别为58%和50%,二者同样不具统计学差异。在本研究所测定的全部病人标本中,巢式PCR和GM测定同时阳性和同时阴性的标本各10份,二者检测结果的符合率为44%(20/45);14份标本巢式PCR阳性而GM阴性,占总数的31%(14/45);11份标本GM阳性而巢式PCR阴性,占总数的24%(11/45);不符合率为56%(25/45)。20份健康体检者血清标本巢式PCR结果均为阴性,特异度100%;GM结果1份 阳性,特异度为95%。

表2 临床标本巢式PCR和GM测定结果

3 讨论

PCR方法在侵袭性曲霉感染诊断的实验研究中显示出较大的优势[2,3]。Klingspor等[2]用实时PCR检测了1650份可疑侵袭性真菌感染标本,1330份血标本中19份(1.4%)曲霉PCR阳性,均来自17例免疫抑制病人,曲霉血培养均为阴性,两例BAL培养证实肺曲霉感染。Benjamin等[3]对来自干细胞移植患者肺泡灌洗液标本进行了侵袭性肺曲霉的检测,比较了实时定量PCR和GM两种方法,其敏感性分别为67%和61%,特异度则分别为100%和98%。尤其适用于高危患者,可避免创伤性诊断操作,具有快速、简便及早期等优点。

应该看到,PCR方法用于临床曲霉感染的诊断,还存在一些障碍:在技术方面,由于曲霉胞壁厚实坚韧,提取DNA困难,临床标本中即便存在曲霉孢子,也不易得到阳性结果;另一方面,由于标本采集和实验操作过程中易受空气中真菌的污染,也易导致假阳性的出现。在病人方面,由于病灶内曲霉DNA向血循环中释放的规律及动力学尚未明了[1],不易把握阳性标本的采集时机。因此,到目前为止,测定曲霉DNA的PCR方法还未被临床实验室广泛采用。

我们在成功建立烟曲霉播散性感染动物模型的基础上,进一步评价巢式PCR在诊断中的应用价值。为了增加检测的敏感性,本实验选取巢式PCR方法,该法比常规PCR方法的检测限要高出几个数量级[6,7]。关于标本类型,我们选择血清,因其易于采集、方便处理和保存,并有研究发现血清检测限比全血要低[8]。

对动物血清标本的检测结果显示,接种感染的第2天即可检测出阳性结果,并可持续数日。由于同一血样培养未见曲霉生长,一方面说明检测出的DNA并非来自接种后在血液持续循环的曲霉孢子,同时也说明巢式PCR在烟曲霉深部感染的早期诊断中具有较高的敏感性。20份标本中有4份阴性,提示烟曲霉基因释放的不连续性,但连续检测可避免假阴性的出现。部分孢子侵入到血液中首先被机体免疫细胞所识别进而破坏,释放出其DNA;其余大部分孢子则很快随血流分布到脏器并在其中增殖。这可能是血清PCR检测阳性而血培养阴性的原因,也可理解为临床侵袭性烟曲霉感染血培养阳性率极低的原因。

巢式PCR和GM实验检测确诊IA患者1例,结果均为阳性;1例临床诊断IA患者4次检测结果均为阳性;另1例患者4次检测结果前两次阳性,后2次则为阴性,其可能是由于药物的治疗与烟曲霉基因释放有关[1]。巢式PCR敏感度稍高于GM的敏感度,但二者之间差异不具统计学意义。二者检测结果符合率达到44%,说明将二者联合应用将有效的增强检测的准确性。14份标本检测结果为巢式PCR阳性而GM阴性,排除污染的可能,说明巢式PCR具有更高的诊断价值。

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[4]周万青,李芳秋,王立魁,等.烟曲霉深部感染家兔模型的建立[J].现代检验医学杂志,2009,24(2):86.

[5]中华内科杂志编辑委员会.血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)[J].中华内科杂志,2005,44(7):554.

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