吲哚草酰类鬼臼毒素衍生物的合成及其抗肿瘤活性

唐啸威 ，谢文利 ，陈 虹 ，，田丹丽 ，左 松 ，白淑芳

（1.天津医科大学药学院，天津300070；2.武警医学院生药学教研室，天津 300162）

鬼臼毒素类化合物具有很好的抗肿瘤活性，依托泊苷和替尼泊苷是临床上长期使用的鬼臼类抗癌药物[1]，据文献报道，鬼臼毒素类化合物的细胞毒性作用机制主要有2种:（1）抑制微管组装；（2）抑制拓扑异构酶II的活性[1-4]。然而，这类化合物还存在水溶性差、获得性耐药、骨髓抑制和严重的胃肠道反应[5]。由 Knaack 等[6-8]报道的 indibulin（D-24851）是一类新型的小分子微管蛋白抑制剂，其化学结构为 N-(吡啶-4-基)-[1-(4-氯苄基)吲哚-3-基]草酰胺，该化合物在体内和体外抗肿瘤实验中均显示出很强的抗肿瘤活性，现已作为抗肿瘤候选药物进入临床研究阶段。而根据前期的构效关系研究[9]，鬼臼类抗肿瘤药物的最佳修饰点在4位，且保持4位的β构型很重要。本课题组以抗肿瘤获选药物indibulin和鬼臼毒素为先导化合物，根据药物结构拼合原理，在前期研究的基础上，设计并合成了一系列的鬼臼毒素衍生物，以期得到对多药耐药有效、低毒高效的抗肿瘤化合物。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 所用仪器为XT显微熔点仪 (温度未经校正)；高分辨质谱仪Agilent 6210 LC-TOF。4’-去甲表鬼臼毒素购自上海金和生物技术有限公司，纯度均为98%；氢化钠为市售分析纯，含量为57%；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）使用前用 4魡 分子筛预干燥处理；无水乙醚和四氢呋喃（THF）均用硫酸钠预干燥后加入钠回流，二苯甲酮作为检测，当溶液变为深蓝色后蒸出备用；无水二氯甲烷用五氧化二磷回流4 h后现蒸现用。其余试剂均为市售的分析纯或化学纯试剂。阳性对照药依托泊苷（VP-16），江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字号：H32025583，产品批号：09090731。

1.2 合成方法

1.2.1 合成路线 目标化合物的合成路线如图1。

图1 目标化合物的合成路线Fig 1 Synthetic route of title compounds

1.2.2 4β-叠氮-4’-去甲表鬼臼毒素的合成 将4’-去甲表鬼臼毒素 4.14 g（10 mmol）溶于 50 mL 干燥二氯甲烷中，加入叠氮钠 2.60 g（40 mmol），搅拌使其溶解,缓慢滴加10 mL三氟乙酸至反应液中,回流5 h。TLC检测反应完成后，滴入碳酸氢钠饱和溶液除去过量的酸，至无气泡为止，萃取分出有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，粗品用二氯甲烷:乙酸乙酯（v/v=1∶1）重结晶，得白色晶体 3.99 g，收率 91%。

1.2.3 4β-氨基-4’-去甲表鬼臼毒素的合成 将4β-叠氮-4’-去甲表鬼臼毒素 4.39 g（10 mmol）溶于50 mL乙酸乙酯中，加入体积质量分数10%钯碳1.00 g，甲酸铵2.52 g(40 mmol)，加热回流搅拌5 h，TLC检测反应完全，滤液用饱和食盐水洗3遍，减压蒸干得白色泡沫状固体粗产物3.63 g，收率83%，粗品可直接用于下一步反应。

1.2.4 化合物5a-5h的合成通法 将质量分数96%氢化钠 0.51 g（20 mmol）溶于 5 mL 干燥 N，N-二甲基甲酰胺中，冰浴下，将5-甲氧基吲哚1.19 g（10 mmol）的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴入氢化钠溶液中，加入完毕后，移去冰浴，室温搅拌反应5 h。冰浴下加入卤代物（12 mmol），移去冰浴，室温搅拌，TLC检测反应完毕。将反应液倒入冰水混合物，不断搅拌，直至析出固体不再增加，抽滤得固体，40℃减压干燥24 h，得到粗品，粗品直接用于下一步反应。

1.2.5 化合物6a-6h的合成通法 将上述制备的1-取代5-甲氧基吲哚（5.0 mmol）溶于20 mL无水乙醚，冰浴冷却反应液至0℃，在此温度下，将草酰氯0.58 mL（6.5 mmol）缓慢滴加至反应瓶中，滴加完毕后，室温搅拌反应3～6 h，抽滤，用预干燥的石油醚洗涤，粗品不经分离纯化可直接用于下一步反应。

1.2.6 化合物7a-7h的合成通法 将4β-氨基-4’-去甲表鬼臼毒素0.42 g（1.0 mmol）与制备的化合物6a-6h（2.0 mmol）溶于15 mL干燥二氯甲烷中，搅拌使其溶解，滴加两滴三乙胺，室温反应4～12 h。反应完毕，饱和食盐水洗3遍，分出有机层，减压蒸干得粗品，粗品经硅胶柱层析（石油醚－乙酸乙酯=1:1）纯化得产品。

1.3 MTT法检测体外抗肿瘤活性 取对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板内，每孔约含4000个细胞，置37℃，5%CO2温箱中培养。培养24 h后给药组加入测试物，至少设3个平行孔，阴性对照组加入与给药组等体积的溶剂，并设只加培养基的空白对照组，置37℃，5%CO2温箱中培养48 h后弃培养液，每孔加50 μL 1 mg/mL MTT溶液（PBS配制），37℃孵育 4 h，弃上清，每孔加入 DMSO 150 μL溶解甲臜颗粒，轻度振荡溶解。在酶标仪波长490 nm条件下测定光密度值（OD），用下面公式计算化合物对细胞的抑制率，根据计算出的抑制率和相应的浓度用Excel工作表拟合出相关联的曲线，推测出IC50值，实验平行3次。

抑制率=(阴性对照组OD值-加药组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%[10]

2 结果

2.1 对合成的8个目标化合物进行了高分辨质谱的确定以及熔点的确定，具体理化常数及波普数据见表1。

表1 目标化合物的理化常数和波谱数据Tab 1 The experimental and spectral data of target compounds

2.2 药理活性测定结果表明，所测试的8个化合物对人宫颈癌细胞Hela显示出不同程度的抑制活性，其中7a、7b的抗肿瘤活性优于对照药物依托泊苷，化合物7g、7h的体外抗肿瘤活性相当于对照药物依托泊苷。见表2。

表2 目标化合物对Hela细胞增殖的抑制活性（±s,n=3）Tab 2 Inhibitory activity of target compounds against Hela cell proliferation（±s,n=3）

表2 目标化合物对Hela细胞增殖的抑制活性（±s,n=3）Tab 2 Inhibitory activity of target compounds against Hela cell proliferation（±s,n=3）

IC50(μmol·L-1)1.12±0.130.58±0.2016.01±3.0710.01±1.42>10079.96±2.118.19±0.783.56±1.342.11±1.17化合物7a 7b 7c 7d 7e 7f 7g 7h依托泊苷

3 讨论

构-效关系表明，N位苄基的对位有给电子基团效果不好，如7e、7f基本没有抗肿瘤活性；N位苄基的邻位的卤素有弱的吸电子作用，因此7c、7d的IC50浓度虽然比VP-16的浓度大，但表现出较弱的抗肿瘤活性；7h苄基上间位氯原子强的吸电子效应，活性与VP16相当。因此，吲哚N位上的取代基对吲哚草酰类鬼臼毒素衍生物的抗肿瘤活性影响很大，其中吲哚N位苄基上的吸电子基的衍生物值得进一步研究。

在合成路线的选择上，先选择修饰吲哚的N位。考虑到吲哚3位引入去甲表鬼臼毒素，而吲哚N位引进R基时需要用到强碱，会破坏去甲表鬼臼毒素的内酯环。关于溶剂的选择：（1）在吲哚N位烃化的过程中，笔者采用NaH活化N-H，以干燥DMF为溶剂。选此溶剂的优点是：当反应完成后，由于生成物结构中没有对碱敏感的基团，DMF能与水互溶而生成物不溶于水，所以采用打浆法将DMF倾入冰水中，可以简便地得到产物而不需经过色谱分离；但是在该过程中，DMF的用量不能过大，否则会导致产物不能完全析出且产物粘稠不易干燥。（2）在3位引入草酰基的过程中，笔者使用干燥乙醚作为溶剂，该选择具有显著优势：当3位生成酰氯后，得到的产物极性大大增加，将迅速从乙醚中析出。此外，待反应完毕后可以加入适量的干燥石油醚，从而使溶剂的极性进一步减小，有利于产物的充分析出。

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