八肽胆囊收缩素抑制LPS诱导的RAW264.7细胞AP-1活性及IL-6表达

倪志宇，董 玫，徐之璐，文 迪，李淑瑾，丛 斌

(河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄 050017)

激活蛋白-1(activator protein 1，AP-1)是重要的转录因子，在炎症发展过程中起着关键的转录调控作用［1］。研究发现，AP-1的过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放是引起内毒素休克(endotoxin shock，ES)、ARDS以及 MODS发生的重要机制［2－3］。

八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)属小分子肽类物质，参与调节中枢神经、内分泌、免疫等多系统机能活动。研究表明［4－6］，CCK-8具有抗ES作用，可通过一系列信号通路抑制 TNF-α、IL-1β 等多种炎症介质的表达［7－8］，从而发挥抗炎作用。但CCK-8是否通过AP-1通路调控炎症反应尚未见报道。本研究将观察CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞 IL-6表达及AP-1 DNA结合活性的影响，以进一步阐明CCK-8的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 RAW264.7细胞(同济医科大学);大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide E.coli 0111:B4)、CCK-8(美国Sigma公司);AP-1 Consensus Oligonucleotide、NP-40、DTT、HEPES、AMV 逆转录酶(美国Promega公司);［γ-32P］ATP(北京亚辉生物公司);苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(美国AMRESCO公司);小鼠IL-6 ELISA Kit(法国Diaclone公司);TRIzol(美国 Invitrogen公司);Taq DNA聚合酶(上海Sangon公司)。

1.2 细胞培养及分组 RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数生长期时，以1×105个细胞/孔接种于24孔板(用于ELISA检测)，或调整细胞浓度为每瓶1×107细胞(用于RT-PCR及EMSA检测)，加入无血清RPMI 1640培养基及不同处理因素，孵育细胞。分组:①LPS诱导RAW264.7细胞不同时间IL-6的表达:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L－1)，分别孵育0、3、6、12、24 h;② 不同浓度 CCK-8 对 LPS 诱导RAW264.7细胞IL-6表达及AP-1 DNA结合活性的影响:对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的生理盐水;LPS组:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L－1);LPS+CCK-8组:细胞培养基中先加入CCK-8(10－10、10－8、10－6mol·L－1)，孵育 10 min 后加入LPS(1 mg·L－1);CCK-8组:细胞培养基中加入CCK-8(10－8mol·L－1)。以上各组分别孵育不同时间后检测细胞IL-6及IL-6 mRNA(24 h)的表达及AP-1 DNA结合活性(1 h)。……