日本血吸虫22.6kD重组抗原二步金标免疫渗滤法诊断家畜血吸虫病的初步研究

付 媛，何永强，卢福庄，顾 昀，石团员，冯尚连，张雪娟

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江出入境检验检疫局 技术中心，浙江 杭州 310012)

日本血吸虫病是一种由日本血吸虫寄生引起肝脏、肠道以及其他器官损伤的人畜共患病。日本血吸虫病的血清学检测方法，还存在着操作繁复，需要特殊仪器和设备不足等条件的限制，并且抗原的获得需要血吸虫人工感染兔，制备周期长，所以本研究利用基因工程技术克隆表达重组抗原，建立了重组抗原胶体金免疫渗滤法(RAg-T-DIGFA)，快速简便适用于家畜血吸虫病的现场诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

待检血纸血清制备保存。湖北、四川、浙江等省经粪孵法检测日本血吸虫阳性牛血纸25份，阴性牛血纸68份。人工感染日本血吸虫牛，兔，感染前后分别采血，制备血纸。采集血纸，待检血液将滤纸浸透，晾干，4℃保存备用。检测时用打孔器裁取待检干燥血纸圆片(0.24 cm2)，由250 μL生理盐水浸透30 min后备用。待检血清包括血吸虫感染猪血清4份，猪蛔虫病血清2份，猪囊虫病血清4份，猪旋毛虫病血清2份，猪弓形虫病血清3份，血吸虫人工感染牛血清45份，血吸虫人工感染兔血清15份，健康猪、兔、牛、羊血清5份，牛羊肝片吸虫血清4份由本室保存，检测时用生理盐水1∶40倍稀释后备用。

胶体金溶液的制备。胶体金溶液制备参照Slot［1］柠檬酸钠-鞣酸还原法稍作改进，制成的胶体金颗粒直径为10～12 nm。

重组蛋白的制备。按照本研究室报道的方法［2］进行，已构建好的表达质粒 pGEX-kg-sj22.6在大肠杆菌中表达，用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化的重组蛋白，用SDS-PAGE和Western blot方法检测其免疫原性，并通过Dnastar软件包分析其序列信息，用紫外分光光度计测量其浓度。

重组抗原与金溶胶的交联。胶体金溶液用0.25 mol·L－1K2CO3将 pH调至重组蛋白的等电点偏碱性，根据文献［3］中的方法用10%NaCl确定待标记蛋白最适用量，100mL胶体金中加入血吸虫重组抗原GST-Sj22.6抗原320 μL包被胶体金，加入终浓度为适量的BSA和0.05%防腐剂叠氮钠，分光光度计测量其525 nm处D值为1.8～2.0之间，置4～8℃保存备用。

反应盒。由3部分组成:小盒为4 cm×3 cm×0.6 cm的塑料扁盒，分盒底与盒盖2部分，盖上有5个直径为0.5 cm的椭圆孔;吸水垫料，市售;硝酸纤维素膜，为浙江台州四甲生化材料厂产品，孔径为 0.45 μm。

T-DIGFA诊断试剂盒。由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所提供。该试剂盒由反应盒、金标诊断试剂、洗涤液组成。

1.2 方法

RAg-T-DIGFA反应程序。具体方法参考卢福庄等［2］建立的方法进行，用内径1 mm玻璃毛细管吸取待检血纸浸出液，将血纸浸出液样品依次点在塑料反应盒中央孔的硝酸纤维素膜上，每个反应盒可以点10份样品，结合3 min后滴加洗涤液pH 6.24 PBS 50 μL待渗入后加胶体金探针50 μL，最后加洗涤液50 μL，以洗去未结合的金标记结合物。如在膜上显现红色斑点为阳性，粉色或者淡黄色为阴性。

敏感性和特异性试验。感染血吸虫尾蚴50～500条的牛4头，人工感染血吸虫尾蚴50～500条的兔5只，在感染后0、7、14、21、28、35、42 d(兔为41 d)时分别采血制备血纸。经解剖冲虫法确诊感染1对血吸虫的牛血纸。检验RAg-T-DIGFA法的敏感性。以T-DIGFA法检测健康牛、兔血清共25份、人工感染血吸虫的牛兔血清47份、自然感染肝片吸虫的牛羊血清6份、人工感染蛔虫的猪血清6份、自然感染的旋毛虫病猪血清2份及弓形虫病猪血清4份。观察RAg-T-DIGFA方法与感染其他寄生虫家畜的抗体之间有无交叉反应。

重复性及稳定性试验。不同时间制作3批次重组抗原胶体金诊断试剂，测定自然感染、人工感染血吸虫阳性牛、猪、兔血纸样品25份及血吸虫阴性牛、羊、猪、兔血纸样品40份，判定的阳性符合率和阴性符合率。同批次生产的胶体金诊断试剂一部分放置室温保存，另一部分置4～8℃冰箱保存。间隔不同时间(第1个月每周测定1次，第2个月每15 d测定1次，第3个月后每个月测定1次)测定血吸虫病阳性及阴性血纸各20头份，观察诊断试剂在不同温度、不同时间保存的有效性。

与T-DIGFA方法的比较试验。T-DIGFA按照卢福庄等［3］报道的方法进行检测。共检测牛血纸样本136份，比较两者的符合率。

各地临床采集样品的检测结果。由黑龙江、浙江、湖北、四川等地采集血纸片118份，用RAg-T-DIGFA法检测。

2 结果和分析

2.1 重组蛋白的纯化

用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化的重组蛋白GST-Sj22.6经SDS-PAGE和 Western blot方法检测具有良好的免疫原性(图1)，通过Dnastar软件包分析其分子量为49.7 kD，等电点为6.48。经分光光度计检测其浓度为2.44 mg·mL－1。

图1 重组蛋白GST-Sj22.6的Western-blot分析

2.2 RAg-T-DIGFA最佳实验条件的确定

经过筛选重组抗原标记用量和标记 pH，确定100 mL制备好胶体金溶液中用0.25 mol K2CO3350 μL标记重组抗原用量为320 μL即0.781 mg。在室温22℃时，在含终浓度为0.05%Tween-20，1%BSA，0.1% 叠 氮 钠 的 pH 5.91、pH 6.24、pH 6.47、pH 6.64的PBS中选择 pH 6.24的 PBS作为洗涤液。

2.3 敏感性及特异性

用RAg-T-DIGFA法检测人工感染血吸虫尾蚴牛、兔血纸片，检测出人工感染血吸虫尾蚴28 d和21 d以上的阳性牛和兔血纸抗体。可以检测出经解剖冲虫法确诊感染1对血吸虫的牛血纸。用RAg-T-DIGFA法检测各类血清抗体，检测结果发现与肝片吸虫、蛔虫、弓形虫、旋毛虫病血清之间无交叉反应见表1。

2.4 重复性及稳定性

3个批次制备的重组抗原胶体金试剂血吸虫阳性血纸样品25份及血吸虫阴性血纸样品40份，判定的阳性符合率和阴性符合率均完全相同。说明该方法的重复性良好。同一批血吸虫抗原胶体金在4～8℃保存期6个月仍有效，室温保存期为3个月。说明RAg-T-DIGFA试剂盒的稳定性良好。

表1 RAg-T-DIGFA对各类血清抗体检测结果

2.5 与T-DIGFA方法的比较

RAg-T-DIGFA和T-DIGFA方法共检测血纸阳品136份，结果阴性符合率和阳性符合率均为100%。

2.6 RAg-T-DIGFA的临床样品检测

共检测各地血纸样品118份，检出阳性血样6份，阳性率达到5.08%(表2)。

表2 RAg-T-DIGFA的临床样品检测结果

3 小结与讨论

本研究建立的重组抗原金标免疫渗滤法是在二步金标免疫渗滤法的基础上首次将基因重组技术获得的重组抗原应用在二步金标免疫渗滤法上，解决了抗原获得周期长的问题，同时该法具有抗原容易制备的特点。

日本血吸虫重组抗原rGST-Sj22.6与虫卵抗原相比具有抗原稳定的优点，纯化透析完成的重组抗原可以在20℃保存2年以上，可以用于二步金标免疫渗滤法。金标免疫渗滤法是一种快速简便的诊断方法，已应用于人血吸虫病的血清学诊断［4－7］。

构建完成重组质粒后重组抗原的制备过程自动化程度高、制备时间短，可利用发酵罐大量制备，在两个星期中可以纯化制备500 mg左右的重组抗原，价格低廉，与日本血吸虫人工感染家兔的方法获得的虫卵抗原相比节约时间和成本。同时，重组抗原是抗原基因在菌体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌为表达菌株，除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性。

RAg-T-DIGFA具有良好的敏感性、特异性、重复性和稳定性等特点，同时操作简便，检测周期短，检测10份样品仅需约10 min，便于在基层推广使用。

虽然重组抗原经过用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化，但是仍有少量的大肠杆菌菌体蛋白存在，可能是影响RAg-T-DIGFA与T-DIGFA相比所用抗原量较多的原因。

［1］Slot J W，Geuze H J．A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry［J］．Eur J Cell Biol，1985，38(1):87-93.

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［3］卢福庄，方兰勇，张雪娟，等．检测家畜血吸虫抗体的二步金标免疫渗滤法研究［J］．畜牧兽医学报，2006，37(7):687-692.

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［5］沈丽英，干小仙，丁建祖等．金标免疫渗滤法(DIGFA)快速检测血吸虫循环抗原的研究［J］．中国人畜共患病杂志，2000，16(1):12-14.

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