低氧条件下喉癌Hep-2细胞Stat3和HIF-1α表达关系的研究

路秀英 李晓明

缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一个转录因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，对于VEGF的激活有重要意义。信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)信号通路在人类多种肿瘤中持续激活，影响肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润及转移。研究发现内部存在低氧情况的实体肿瘤如Hep-2细胞Stat3的激活与低氧时间存在一定联系，对于细胞的生长、增殖和转移产生重要影响，并可能对HIF-1α的调节具有重要作用。本文应用喉癌Hep-2细胞体外实验检测低氧条件下p-Stat3表达和HIF-1α表达的关系，并进一步检测应用反义寡核苷酸抑制p-Stat3表达对低氧时HIF-1α表达的影响，旨在探明低氧时喉癌Hep-2细胞p-Stat3表达和HIF-1α表达的关系，为靶向Stat3的喉癌基因治疗新策略奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人喉癌细胞系Hep-2购买自中国科学院上海生命科学院，在含有10%新生小牛血清与RPMI 1640培养基中培养。MTT为Sigma公司产品。脂质体LipofectamineTM 2000为Invitrogen公司产品。全硫代修饰Stat3 AS-ODN和S-ODN由上海生工生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 低氧条件设置 低氧培养实验条件为37℃、5%CO2、2%O2、93%N2，实验在特制的低氧培养箱中进行，具体制作参见参考文献［1］。培养结束后抽取细胞培养液作血气分析(IL1400型血气分析仪，Instrmentation Labrotory，USA)，氧分压为(2.9 ～4.7kPa)，低于常氧对照组氧分压(21.1～21.3kPa)，达到低氧培养要求。

1.2.2 低氧处理 进入对数生长期细胞随机分组为常氧及低氧3、6、12、24h组，按分组时间分别收集细胞，流式细胞技术检测p-Stat3、HIF-1α及VEGF蛋白表达。每组设平行对照3例，实验重复3次。

1.2.3 基因转染及检测 随机分组为空白对照组、脂质体对照组、Stat3 AS-ODN(100、200nmol/L)转染组、Stat3 S-ODN(100、200nmol/L)转染组。……