p16INK4A在宫颈非典型鳞状细胞中的诊断作用

武 玲，宋静慧

(1.内蒙古妇幼保健院妇产科，呼和浩特010020;2.内蒙古医学院第一附属医院妇产科，呼和浩特010050)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，国内外最新研究表明，宫颈癌是一种感染性疾病，是可以预防、可以治愈的疾病［1，2］。液基薄层细胞学(thinprep cytologic test，TCT)明显提高了对各种宫颈癌前病变的检出率，但非典型鳞状细胞(atypical squamous of undermined significance，ASCUS)由于相当大的重叠对不同的标准会有不一致的判断。因此，临床上迫切需要一种生物标志物作为TCT的辅助手段对ASCUS进行合理检测和随访分流。2003年，Nieh等［3］首次报道了p16INK4A免疫组化染色可成功地应用于宫颈细胞涂片，作为ASCUS涂片辅助诊断的指标有助于澄清这一较模糊的妇科细胞病理学概念。近年来研究显示，抑癌基因p16INK4A几乎在100%的宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ中过表达，认为p16INK4A蛋白有望作为宫颈核异质细胞的标志物并可评估宫颈病变严重程度［4］，提示其可能对ASCUS的再分类起一定的作用。本研究采用TCT诊断为ASCUS的剩余标本进行p16INK4A免疫细胞化学检测，将ASCUS再分类，探讨p16INK4A在宫颈ASCUS中的表达及其诊断价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2006年8月至2007年10月在内蒙古医学院第一附属医院妇产科门诊进行TCT宫颈细胞学检查的患者5321例。选择细胞学检查结果为ASCUS的患者为实验组(148例)，占同期门诊宫颈细胞学检查总数的 2.9%(148/5321)，患者平均年龄为(35.8 ±10.1)岁。ASCUS患者中有白带增多、接触性出血或异常阴道流血等临床症状的病例为 53例，占35.8%(53/148);妇科检查发现宫颈糜烂病例为115例，占 77.7%(115/148)。再根据异常程度和本人意愿进行阴道镜或宫颈病变处的活检。对照组:选择细胞学检查结果为正常宫颈细胞的患者10例;炎性反应性改变20例;低级别鳞状上皮内病变(low squamous epithelium lesions，LSIL)10 例;高级别鳞状上皮内病变(high squamous epithelium lesions，HSIL)10例;鳞癌4例。以上所有病例均为无子宫切除史、宫颈手术史、骨盆放射治疗史，目前无妊娠的妇女。

1.2 标本处理 将TCT的剩余细胞标本放入无菌试管内振荡洗涤，离心沉淀后用稀释后取80 μL用电动离心涂片机甩片，自然干燥后用磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3次。

1.3 试验方法 免疫组化染色采用S-P法:①涂片滴加0.3%过氧化氢甲醇溶液，室温下孵育10 min。②加正常小牛血清，室温下孵育10 min。③倾去血清，加 p16INK4A(2 mg/mL)单克隆抗体，4℃过夜。④加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min，加入链霉菌抗生物-过氧化物酶活物，室温下孵育10 min。⑤磷酸盐缓冲液冲洗涂片后DAB显色，苏木精复染。

1.4 染色观察标准 细胞核或细胞质内出现有棕黄色颗粒为阳性，按其着色有无及强弱程度划分为:癌阳性细胞数＜5%或无阳性着色为阴性(－)，阳性细胞数在6%～25%间为弱阳性(+)，阳性细胞数在26%～50%间为阳性(++)，阳性细胞数＞50%为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组p16INK4A在不同宫颈细胞学中的免疫组化染色结果 在宫颈脱落细胞中，p16INK4A在正常、炎症、ASCUS、LSIL、HSIL、鳞癌中表达的阳性率分别为0% 、5% 、24.3% 、90% 、100% 、100% 。不同程度的宫颈疾病的细胞免疫化学，其p16INK4A表达差异有统计学意义(χ2=62.67，P ＜0.05)(表 1)。

表1 p16INK4A在不同宫颈细胞学病变中的表达情况

2.2 实验组148例ASCUS宫颈活检组织病理结果经宫颈活检确诊，148例宫颈细胞学检查为ASCUS的患者中，宫颈 CIN为 39例，占总数的 26.4%(39/148)。其中 CINⅡ级和 CINⅢ级为17例，占CIN的43.6%(17/39)。另外，148例 ASCUS中，宫颈浸润癌为2例，占总数的1.4%(2/148)。

2.3 实验组p16INK4A在ASCUS中免疫组化染色结果148例ASCUS中有36例阳性表达，在经病理证实为2例鳞状细胞癌p16INK4A表达均为强阳性，阳性率为100%。5例宫颈CINⅢ级p16INK4A表达均为强阳性，阳性率为100%。12例宫颈 CINⅡ级阳性率为91.7%。22例CINⅠ级阳性率为77.3%。107例慢性宫颈炎阳性率为0.9%。不同程度的宫颈病变的细胞免疫化学，其p16INK4A表达的差别有统计学意义(χ2=116.65，P ＜0.05)(表2)。

表2 p16INK4A在不同宫颈组织病变中的表达情况［例(%)］

比较p16INK4A的表达在宫颈炎与CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ级之间，宫颈炎与宫颈鳞癌之间，阳性率差异均有显著性(P＜0.05)。比较 p16INK4A的表达在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ级和宫颈鳞癌之间，阳性率均无显著性差异(P＞0.05)，而染色强度均有显著性差异(P ＜0.05)。

3 讨论

子宫颈癌是常见的女性生殖器官恶性肿瘤，但是可以预防，可以治愈的，其关键在于认真筛查宫颈CIN，早期诊断、早期治疗，预防宫颈癌的发生。TCT的出现明显提高了细胞学诊断的准确率、阳性率。在此之前的研究发现，经过长期随访原细胞学诊断为ASCUS的妇女有20%发展为LSIL，10%发展为HSIL［5］。因此，进一步完善和改进宫颈癌前病变筛查和诊断方法，寻找对ASCUS有诊断价值的生物标志物有重要的意义。

p16INK4A基因是1994年6月由美国盐湖城Kamb等［6］报道的一种新型抑癌基因，定位于人染色体9p21，编码含148个氨基酸的核结合蛋白，其产物p16INK4A蛋白参与细胞周期的调节，可与细胞周期素cyclinD1竞争性结合CDK4和CDK6，通过抑制CDK4和CDK6激酶的活性，而使pRb不能磷酸化，从而抑制细胞增殖，同时高磷酸化的pRb可诱导p16INK4A基因的表达。p16INK4A在 CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F细胞周期调节途径中起着负反馈的作用，一旦p16INK4A基因发生变异，上述环路就会无限制地进行下去，最终导致肿瘤的发生。

将p16INK4A免疫组织化学染色检查方法和宫颈细胞学方法结合，尤其对于细胞学诊断为ASCUS的患者，有重要的临床应用价值。Guo等［7］研究进一步证实p16INK4A作为宫颈病变的分子标志物，不仅运用于宫颈组织标本的检测，还运用于对ASCUS的细胞学涂片进行分层处理。本研究中，p16INK4A在宫颈脱落细胞中诊断为正常、炎症、ASCUS、LSIL、HSIL、鳞癌中表达的阳性率分别为0%、5%、90%、100%、100%。在正常宫颈与细胞学诊断的宫颈癌前病变之间均有显著性差异，在慢性宫颈炎与细胞学诊断的宫颈癌前病变之间均有显著性差异，在 LSIL、HSIL、鳞癌之间阳性率均无显著性差异。

2006年，吴韩梅等［8］报道，采用免疫组化法检测p16INK4A发现随着宫颈病变的进展其阳性表达率逐渐升高。Murphy等［9］研究认为p16INK4A免疫反应性在慢性宫颈炎组基本不表达，CINⅠ级为较低强度表达和零星表达，CINⅢ级以上的表达为弥漫表达。这和本研究结果相似，在后来临床随访组织学结果中随宫颈病变的进展p16INK4A染色强度显著增加。试验中可以看出:p16INK4A同样可以应用于TCT细胞学涂片，具有和组织化学同样的阳性预测，背景更加清晰直观，较Bibbo等［10］用TCT标本离心后的细胞沉渣石蜡切片方法简单易行。

总之，p16INK4A辅助应用于宫颈ASCUS的筛查和诊断，其检测方法简单、易于操作，对ASCUS的随访、治疗、预后具有重要价值，有望作为ASCUS再分类的生物学指标。

［1］郎景和.迎接子宫颈癌预防的全球挑战与机遇［J］.中华妇科杂志，2002，37(3):1-2.

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［10］Bibbo M，Klump WJ，DeCecco J，et al.Procedure for immunocytochemical dstection of p16INK4Aantigen in thin-layer，liquid-based specimens［J］.Acta Cytol，2002，46(1):25-29.