阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类抗生素耐药基因分析

罗必蓉，刘蓉，刘继芬，唐玲，蒋宏

（成都中医药大学医学技术学院微生物学及免疫学检验教研室，四川 成都 610041）

近年来阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）已成为医院感染的重要病原菌，该菌对包括氨基糖苷类在内的常用抗生素常呈现多重耐药性，令抗菌感染治疗相当困难。为了解成都地区阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶（Aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）基因存在情况，我们对临床分离的33株阴沟肠杆菌进行了药敏实验，并检测了9种AMEs基 因：aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（3）－Ⅲ、aac（3）－Ⅳ、aac（6′）－Ⅰ、aac（6′）－Ⅱ、ant（3″）－Ⅰ、ant（2″）－Ⅰ、aph（3′）－Ⅵ，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定

33株试验菌株分离自成都地区3家医院2009年10月至2010年5月住院患者送检的各种标本，其中痰液27份、尿液4份、伤口分泌物2份。采用Bio－Merieux公司API 20E鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 药敏试验

微量肉汤法，采用美国Bio－Merieux公司产品ATB G－5药敏试验板，共测试18种抗菌药物的敏感性。

1.3 基因检测

采用聚合酶链反应（PCR）法检测AMEs基因，用蛋白酶K消化法制备DNA扩增模板。根据GenBank中已发布的AMEs基因序列自行设计引物，上海生物工程有限公司合成引物；PCR扩增引物序列及产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系 为：P1、P2 引 物 各 0.5μmol／L，KCl 10.0 mmol／L，（NH4）2SO48mmol／L，MgCl22mmol／L，Tris－HCl（pH 9.0）10mmol／L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反应体积20μl，其中模板液5μl。热循环参数为93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，共35周期；最后1个循环72℃延伸至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，伊凡思蓝（EB）染色，紫外灯下观察结果，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。PCR技术及基因检测阳性对照由本实验室筛查并经测序证实，纯水为阴性对照。

序列分析PCR产物经纯化后，送北京三博远志生物技术有限公司测序，并将测得序列与GenBank中已发布序列进行比较。……