酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状

张 琴（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

0 引言

燃料乙醇近年来在国内外得到了迅速发展，但目前基于粮食类淀粉质原料的燃料乙醇，已经引发了全球范围内的争议。以各类农林废弃物为代表的木质纤维素类生物质［1］是地球上最丰富的资源，以其为原料生产燃料乙醇，不仅可以解决当前以粮食类淀粉质原料生产燃料乙醇产生的诸多问题，而且可以促进农村经济发展。然而木质纤维素类生物质水解糖［2］中含有不能被乙醇发酵性能优良的酿酒酵母利用的、以木糖为主要成分的五碳糖，因此能够高效利用木糖生产乙醇菌株的选育，是木质纤维素类生物质资源生产燃料乙醇［3］的关键技术之一。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是乙醇发酵的优良菌株，但缺乏木糖代谢途径。通过代谢工程和基因工程构造可利用木糖的工程酿酒酵母方面已有了许多研究。但一般乙醇产量低，副产物产量高。

为解决在酿酒酵母中利用木糖生产乙醇产量低副产物木糖醇［4］含量高，已经进行了许多研究。获得性能优良的木糖发酵酵母是提高木糖发酵酵母与酿酒酵母原生质体融合株木糖发酵性能的重要途径。比如对其细胞膜上的转运体进行改造，以提高细胞摄取木糖的能力。或者通过进化工程及驯化

手段对重组酵母或融合子进一步改良。

1 木糖的代谢途径

不同微生物中木糖代谢途径也不一样，在许多真菌及酵母菌中经过两次氧化还原。D-木糖在辅因子NADPH和NAD+作用下就可以转化为D-木酮糖。即木糖先在依赖NADPH的木糖还原酶（XR；EC1.1.1.21）的作用下生成木糖醇［5］，接着又在依赖NAD+的木糖醇脱氢酶（XDH；EC 1.1.1.9）的作用下氧化为D-木酮糖［6］。最后又在木酮糖激酶（XK；EC 2.7.1.17）作用下磷酸化生成5-磷酸D-木酮糖（X5P）［7］，而5-磷酸D-木酮糖又通过戊糖磷酸化途径（PPP）进行下一步代谢，因该反应中消耗ATP故反应速率取决于供能和细胞的磷酸化。酿酒酵母不能利用木糖，但有可编码XR（YHR104w，GRE3；et al.2002），XDH（YLR070c，ScXYL2；Richard et al.1999）和XK（XKS1；Yangand Jeffries 1997；Richard et al.2000）的基因，只是表达水平低，不能作用于木糖。

在大部分细菌中，D-木糖可以在木糖异构酶（XI；EC 5.3.1.5）作用下直接生成D-木酮糖［8］。如在真菌中在XK作用下D-木糖可被磷酸化为D-木酮糖。据报道一些真菌和酵母菌都有XI活性。

2 XR和XDH的表达

基因XYL1［9］和XYL2［10］杂交表达在酿酒酵母中可形成XR和XDH为在酿酒酵母中进行木糖发酵提供了例证。尽管可通过厌氧发酵将木糖转化为乙醇，但为了得到足够的木糖仍需通氧，这会降低糖消耗速率，另外许多可进行木糖发酵的酵母菌会产生副产物木糖醇。这是因为依赖NADPH的XR和限制性依赖NAD的XDH酶之间的差异，尽管PsXR依赖NADPH但菌株P.stipitis是同时拥有NADPH，NAD特性XR的少数酵母中的一种，在木糖发酵过程中会产生木糖醇。

在S.cerevisiae菌系表达PsXR和PsXDH的过程会产生大量的木糖醇这将会降低乙醇的产量［11］。故应对S.cerevisiae进行改进，实验表明XDH的相对含量比XR高就可以增加乙醇含量降低木糖醇的产量，最近研究还表明PsXR和PsXDH活性都高对于S.cerevisiae菌系产生足够木糖有利。

3 XI表达

在S.cerevisiae中由xylA基因所控制表达的XI是很低的。研究表明从E.coli和Streptomyces rubiginosus中得到的xylA的杂交表达可产生加速形成活性蛋白的可溶性蛋白［12］。在S.cerevisiae中的不成功表达主要因为蛋白的错误折叠。表达在S.cerevisiae中第一个XI来自Thermus thermophilus，虽然对XI的遗传性进行修复可以减少副产物木糖醇的产量，但这种酶在S.cerevisiae的生长条件下不利于酶最大活性的发挥。我们也可在S.cerevisiae内建立了一些细菌和真菌的XI途径，实际上一项最新研究表明一种从Clostridium phytofermentans中分离出来的高活性的XI已经成功表达，它在S.cerevisiae中受木糖醇影响很小［13］。

引入XI途径代替XR-XDH途径是降低木糖醇产量的方法之一，XI不需要还原协同因子而且在木糖发酵过程中不会扰乱分子间还原反应的平衡。比较发现XI途径比XR-XDH途径有更高的产量且副产物少，但XI途径速率低。但是，XI要在强大引发剂的作用下才能进行表达。

4 利用S.cerevisiae的木糖利用系统改进乙醇发酵

作为S.cerevisiae引入的木糖向木酮糖的转化途径补充，为提高木糖转化为乙醇的速率和产率，我们以采取措施对新陈代谢过程和基因进行改造，在这里介绍一下最重要的工程方法。主要包括XK的过表达，打破细胞间还原平衡，木糖转化的工程化加强了ppp。

4.1 XK的表达

酿酒酵母可缓慢催化D-木糖，D-木酮糖的异构化反应。低木酮糖消耗量也可理解为低内源XK活性，这会限制木糖发酵。Hoetal.（1998）［14］第一个培育了重组酵母菌，在它体内XKSI编码的从S.cerevisiae中提取的XK用一种酵母穿梭质粒过表达，同时还有PsXR和PsXDH基因。由染色体PsXR，PsXDH，ScXR联合表达的稳定重组的酿酒酵母也已经形成，这些重组酵母可以进行木糖发酵，葡萄糖和木糖辅酶发酵，但会略微降低乙醇产量。已经有报道说ScXR基因过表达而PsXR，PsXDH正常表达也可以生产乙醇。尽管这些努力都对重组酿酒酵母木糖发酵产乙醇工业做出了改进，但木糖醇仍是重要的副产物。

对于XK活性水平，Ho et al.（1998）曾报道过ScXK基因的过表达，PsXR，PsXDH正常表达会增加乙醇产量并降低副产物木糖醇的产量，相反的Rodriguez-Pena et al.（1998）［15］的报道表明ScXK基因的过表达会抑制木酮糖产量，Johansson et al.（2001）［16］研究发现ScXK基因的过表达会增加乙醇产量却大大降低酿酒酵母中的木糖的消耗，Jin et al.（2003）［17］发现高表达XYL3基因编码的来自酿酒酵母的XK基因及高水平表达PsXR和PsXDH会抑制木糖细胞的生长而适当表达PsXR会促进细胞生长。PsXK比ScXK特异性好。在研究中XK的过表达没表现出抑制作用，在Matsushika和Sawayama（2008）［18］研究中发现适中ScXK活性和高PsXR，PsXDH活性会增加乙醇产量并降低木糖醇产量但并没有出现由于XK的过表达而引起的木糖细胞生长或产量降低现象。因此只有酿酒酵母中XK基因有序高表达才有利于木糖产乙醇条件优化，因此只有在细胞异常积累X5P而缺少ATP条件下引起XK过表达会减少乙醇产量。

4.2 氧化还原平衡

PsXR和PsXDH之间由于辅酶不同而引起细胞内氧化还原平衡的破坏会使木糖醇含量增加，为减少木糖发酵过程木糖醇形成。Jeppsson et al.（2002）［19］，构建一种可表达PsXR和PsXDH的重组酿酒酵母，主要通过GND1和ZWF1基因降低PPP活性大大产出ScXK。这些基因编码了产生了NADPH的6-磷酸葡萄糖脱氢酶及葡萄糖-6磷酸脱氢酶。与母体相比它们的突变体会有木糖消耗量低乙醇产量高的特性。

酿酒酵母不含有将NADH转化为NADPH的转氢酶，因此会造成细胞溶质的NADH积累。从Azotobacter vinlandii提取的异源转氢酶基因在酿酒酵母中的表达会降低木糖醇产量这可能由于转氢酶反应中形成的还原性NADH，因此利用转氢酶反应的途径对木糖发酵是毫无意义的，另一方面，Verho［20］表明克鲁围酵母乳糖GDP—基因编码了一个依赖NADP+的3-磷酸甘油醛脱氢酶，会增加乙醇的产量，GDP—的过表达伴随着ZWF1基因的缺失，会造成乙醇含量的降低，

另一种减少木糖醇产量增加乙醇产量的比较有前途的途径就是通过修改酿酒酵母中的辅酶或者利用蛋白质工程修改XR或XDH，对于XR，Jeppsson报道［21］，通过表达突变基因减少NADPH，PsXDH和ScXK的亲和性从而达到降低木糖醇含量增加乙醇含量的目的。几种NADH依赖型PsXR突变剂例如K270R和R276H，据报道对乙醇和木糖醇含量的增加具有积极的作用［22］。此外，通过在辅酶结合区域中进行的多重定向突变以及引进一个锌结合位点来增加它的热稳定性［23］，构造了一种完全针对NADP+辅酶特性的反转的几种PsXDH突变剂，其中的一个四倍突变体ARSdR的对NADP+的KCAT/Km值是未突变酶的4500倍，而对于NAD+的KCAT/Km的值与未突变的基本相同。最后，供体控制的ARSdR突变剂的重组酵母可增加木糖生产乙醇的量［24］，并且可以降低木糖醇的含量，这可能主要与保持分子间的氧化平衡有关。

4.3 木糖运输

由于缺乏木糖特异性运载体，酿酒酵母可通过利用非特异性的己糖运载体的易化扩散作用吸收木糖，该载体由HXT系列基因编码［25］，这些载体对葡萄糖亲和性高于木糖而转运木糖的能力和糖亲和力有关［26］。所以葡萄糖运输会竞争性的抑制木糖运输，在葡萄糖消耗完后木糖才被利用。因为酿酒酵母并没有把木糖识别为可发酵碳源，所以运用异源的木糖特异性运载体就非常有用。

在针对所有己糖运载体的缺失突变中单个HXT基因的重新引入和表达强调了HXT4，HXT5，HXT7亲和运载体的和Gal2作为木糖转运蛋白的重要作用［27］。由于HXT5和HXT7只有在木糖作为唯一碳源条件下才会表达故它对木糖转运更为重要。尽管有人尝试通过HXT7和Gal2的过表达来提高木糖发酵效率，但无明显作用。我们应将致力于研究与转运和发酵有关的蛋白体，应关注这些基因如Agt1（可诱导的高亲和性麦芽糖运载体），Snf3（控制葡萄糖运输的质膜传感器）。已有研究表明Agt1运载体是酿酒酵母中转运麦芽三糖的有效因子［28］。

SUT1基因编码的P.stipitis中的运载体在酿酒酵母中成功表达［29］，已有报道表明运载体在木糖中交互表达。此外葡萄糖木糖异化扩散运载体和葡萄糖木糖共输运载体由来自假丝酵母的GXF1和GXF1表达［30］，在酿酒酵母中含有GXF1有更快的吸收木糖和更高的乙醇产率。这些重组运载体的表达提高了木糖发酵效率。

4.4 磷酸戊糖途径

非氧化PPP是将木酮糖转入糖酵解的唯一途径。但在酿酒酵母中该途径效率低且会造成PPP代谢产物积累，会降低木酮糖产量。此外酿酒酵母一般用己糖发酵产乙醇，故非氧化PPP酶例如转醛醇酶，转酮醇酶，5-磷酸核酮糖3-差向异构酶，5-磷酸核酮糖乙酮醇异构酶的过表达均会加强该途径。

内在的转醛醇酶基因和来自P.stipitis的TAL1基因过表达都会增加木糖产量［31］。相反，对来自P.stipitis得TKL1过表达会降低木糖产量［32］。有趣的是对于四种非氧化PPP基因RPE1，RKI1，TAL1和TKL1的过表达会促进木酮糖消耗［33］。

非氧化PPP酶过表达及内源XKS1过表达，GRE3的缺失都会促进木糖生长［34］。不仅在含有微生物性XI，而且在含有Piromyces XI的都会增加木糖的消耗。故木糖转化为木酮糖和PPP活性进有所提高，这对于木酮糖代谢是必须的对酿酒酵母中木酮糖利用也是必须的。故含有非氧化PPP途径可作为促进木糖代谢的起始途径。我们利用微点阵分析法和代谢流量统计对该系统进行了分析。非氧化PPP酶的最优条件还需进一步研究。

4.5 其它代谢过程

磷酸乙酮醇酶途径即将5-磷酸-D木酮糖转化为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸盐已在细菌和红酵母菌系得到探测［35］。对于来自乳酸双歧杆菌的磷酸酮醇酶在利用木糖的酿酒酵母中进行异源表达会减少木糖醇产量［36］，增加磷酸盐累积降低木糖消耗，缺失编码NADPH—依赖型ALD6，会增加乙醇产量和提高木糖发酵效率。在酿酒酵母中有碳产物抑制，即与其它糖相比首先利用葡萄糖，

5 结论和前景展望

本文研究发现木糖醇脱氢酶（XDH）的相对含量比木糖还原酶（XR）高就可以增加乙醇含量，降低木糖醇的产量；ScXK基因的过表达会增加乙醇产量，同时大大降低酿酒酵母中的木糖的消耗，通过表达突变基因减少NADPH，PsXDH和ScXK的亲和性也可达到上述目的。

促进木糖发酵的新研究点主要有转录子，蛋白质组，代谢组和磁通量子这些均可增强木糖产乙醇速率。木糖发酵的蛋白质组分析已经揭露了22种蛋白（如Adh2p、Ald4p、和Ald6p）显示出比葡萄糖高的发酵水平。随着能源价格持续上涨和因温室气体过量排放而导致的全球变暖趋势的愈演愈烈，利用木质纤维素材料生产燃料乙醇已成为世界各国研究的热点。相信随着研究的深入，必将有性能更优良的木糖代谢工程菌应用于燃料乙醇的生产。

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